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130多年前，德國(guó)生物學(xué)家阿爾布雷希特·科塞爾首次從茶葉中提取茶堿。茶堿（theophylline，TEP）作為一種支氣管擴(kuò)張劑，能擴(kuò)張支氣管平滑肌、降低氣道反應(yīng)性并具有抗炎作用，在臨床上用于治療慢性阻塞性肺疾病、哮喘和嬰兒呼吸暫停等呼吸系統(tǒng)疾病。然而，其治療濃度窗口較窄，需嚴(yán)格監(jiān)測(cè)濃度，以免高濃度引發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)。茶堿特異性適體（如短單鏈DNA或RNA）以高特異性、低成本及低免疫原性的優(yōu)勢(shì)，可作為茶堿的生物傳感器用于濃度檢測(cè)。特異性識(shí)別茶堿的RNA適體于1994年由Jenison等人發(fā)現(xiàn)，其配體結(jié)合機(jī)制已被闡明，茶堿DNA適體于2022年由劉玨文團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)，其能特異性識(shí)別并結(jié)合茶堿而不結(jié)合咖啡因，這兩個(gè)小分子僅有一個(gè)甲基的區(qū)別。同時(shí)其對(duì)茶堿的親和力明顯優(yōu)于3-甲基黃嘌呤（3-methylxanthine，3-M）和次黃嘌呤（hypoxanthine，HPA），目前，其結(jié)構(gòu)尚未解析，配體識(shí)別機(jī)制仍不明。

核酸適體主要通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）篩選獲得，但其實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜且特異性難以保證，成本效益限制了其大規(guī)模應(yīng)用。近年來(lái)，多個(gè)研究小組成功利用天然核糖體開(kāi)關(guān)或核酶作為支架，篩選有效新適體，但仍未完全克服傳統(tǒng)SELEX實(shí)驗(yàn)的局限。

茶堿DNA適體整體上呈現(xiàn)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，包含兩個(gè)莖（P1、P2）和一個(gè)配體結(jié)合口袋區(qū)，配體結(jié)合口袋區(qū)由兩個(gè)連接區(qū)J1/2和J2/1組成，表面視圖展示單一的半封閉的配體結(jié)合口袋結(jié)構(gòu)（圖1）。5個(gè)脫氧核苷酸（G1到T5）形成了P1莖的第一條鏈。然后，該鏈延伸到第一個(gè)連接區(qū)（J1/2），該連接區(qū)（G6到C9）形成配體結(jié)合口袋區(qū)域的第一條鏈。之后，DNA鏈通過(guò)向下伸展的堿基（T10）延伸到P2，該堿基是閉合結(jié)合袋的關(guān)鍵核苷酸。A11和T12形成了P2的第一條鏈。隨后，它與兩個(gè)脫氧核苷酸（T13和C14）形成一個(gè)莖環(huán)，然后向下彎曲形成P2的第二條鏈（A15和T16）。繼續(xù)向下，DNA鏈進(jìn)入第二個(gè)連接區(qū)（J2/1），呈現(xiàn)S-turn結(jié)構(gòu)，同時(shí)形成配體結(jié)合口袋區(qū)的第二和第三鏈（A17到C24，其中A17-G19屬于第二鏈，G21-C24屬于第三鏈）。最后，DNA鏈完成了P1莖的第二條鏈（G25到C29）。整體結(jié)構(gòu)的表面視圖展示了一個(gè)單一的半封閉的配體結(jié)合口袋。

圖1. 茶堿DNA適體的整體結(jié)構(gòu)

茶堿DNA適體核心區(qū)域為其配體結(jié)合口袋區(qū)域，位于P1和P2之間，如圖2a所示。該區(qū)域始于P1的G25?T5堿基對(duì)，由四個(gè)三堿基相互作用平面組成，每個(gè)平面都有廣泛的氫鍵相互作用，其中第三個(gè)平面是配體結(jié)合位點(diǎn)。第一個(gè)三堿基相互作用平面涉及G19-（trans Watson–Crick–Hoogsteen）-G6-（cis Watson–Crick）-C24（圖2b），第二個(gè)三堿基相互作用平面G18：G7：C23與第一個(gè)類似（圖2c)。配體結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的小分子與A17和T22形成氫鍵，在第二和第四個(gè)三堿基相互作用平面之間形成一個(gè)中間面板。第四層三堿基相互作用平面包括一個(gè)從C9 N4到T8 O2的氫鍵和一個(gè)C9-（cis Watson–Crick）-G21的堿基對(duì)（圖2d）。

在茶堿DNA適體分別結(jié)合TEP、3-M和HPA的結(jié)構(gòu)中，每個(gè)化合物的嘌呤環(huán)與A17的嘌呤環(huán)和T22的嘧啶環(huán)共面對(duì)齊，同時(shí)形成氫鍵。在結(jié)合TEP的結(jié)構(gòu)中，嘌呤環(huán)的O6和N9接受A17 N6和T22 N3的氫鍵，而N7向A17 N1提供一個(gè)氫鍵（圖2e）。正是由于N7位置的甲基取代，該甲基破壞了與A17 N1的氫鍵相互作用導(dǎo)致該適體無(wú)法識(shí)別和結(jié)合咖啡因。在結(jié)合3-M的結(jié)構(gòu)中，與A17和T22可以觀察到一致的氫鍵相互作用（圖2f）。盡管HPA的親和力比TEP低2000倍，但作者成功地解析了與HPA結(jié)合的茶堿DNA適體的晶體結(jié)構(gòu)，HPA嘌呤環(huán)的N1向A17 N1提供一個(gè)氫鍵，而N3和O6分別接受T22 N3和A17 N6的氫鍵（圖2g）。

圖2. 茶堿DNA適體的配體結(jié)合口袋結(jié)構(gòu)和配體識(shí)別結(jié)合

作者通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)電泳遷移率變化分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）和等溫滴定量熱法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）驗(yàn)證了茶堿DNA適體配體識(shí)別結(jié)合機(jī)制（圖3）。基于結(jié)構(gòu)分析設(shè)計(jì)的特定堿基突變（A17G、T22C和A17G+T22C）破壞了適體與茶堿的氫鍵形成導(dǎo)致適體無(wú)法結(jié)合茶堿，進(jìn)一步驗(yàn)證了晶體結(jié)構(gòu)中觀察到的氫鍵相互作用的正確性。

圖3. 新適體開(kāi)發(fā)策略和生化驗(yàn)證

基于上述配體結(jié)合機(jī)制，作者提出了一個(gè)合理設(shè)計(jì)的靶向茶堿類似物的適體開(kāi)發(fā)策略。配體結(jié)合袋由四個(gè)平面結(jié)構(gòu)域組成，并通過(guò)核苷酸A17和T22的氫鍵相互作用來(lái)穩(wěn)定。作者假設(shè)，配體相互作用的堿基（A17和T22）的定向突變可以在保留整體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的同時(shí)，可以形成特異性識(shí)別茶堿類似物的新適體（圖4a）。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，文章作者在這兩個(gè)位置進(jìn)行了系統(tǒng)突變（合計(jì)15個(gè)變異，不包括野生型），并使用Glide XP進(jìn)行了分子對(duì)接模擬，以預(yù)測(cè)與15個(gè)茶堿類似物的結(jié)合親和力。值得注意的是，preQ1和腺嘌呤作為配體出現(xiàn)，并可能與特定的突變體結(jié)合。突變體DNA-C-T對(duì)preQ₁表現(xiàn)出最佳的對(duì)接分?jǐn)?shù)，超過(guò)了野生型（DNA-A-T）和DNA-C-C。此外，突變體DNA-T-T對(duì)腺嘌呤表現(xiàn)出優(yōu)越的親和力，突變體DNA-C-T次之（圖4b）。這些計(jì)算預(yù)測(cè)結(jié)果通過(guò)ITC實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)于preQ₁，DNA-C-T表現(xiàn)出強(qiáng)結(jié)合（Kd = 1.3 μM），而野生型表現(xiàn)出中等親和力（Kd = 9.0 μM），其他突變體表現(xiàn)出弱結(jié)合或無(wú)結(jié)合（圖4c）。DNA-C-T是目前第一個(gè)報(bào)道的preQ₁ DNA適配體。同樣，DNA-T-T對(duì)腺嘌呤具有中等親和力（Kd = 57 μM），與野生型弱結(jié)合（Kd = 203 μM）形成鮮明對(duì)比，在其他突變體中相互作用可以忽略（圖4d）。通過(guò)ITC進(jìn)行的特異性分析顯示了獨(dú)特的配體識(shí)別：DNA-C-T選擇性識(shí)別結(jié)合preQ₁，而不結(jié)合其類似物（TEP、3-M、HPA、GMP/GDP/GTP，圖4e），同樣DNA-T-T特異性識(shí)別結(jié)合腺嘌呤，而不結(jié)合其類似物（TEP、3-M、HPA、AMP/ADP/ATP，圖4f），這種特異性與計(jì)算預(yù)測(cè)相一致。

圖4. 新適體開(kāi)發(fā)策略和生化驗(yàn)證

作者同時(shí)也解析了DNA-T-T結(jié)合腺嘌呤的晶體結(jié)構(gòu)，腺嘌呤結(jié)合模式與計(jì)算模擬預(yù)測(cè)的結(jié)合模式一致，表明開(kāi)發(fā)適體的靶向突變策略是成功的。腺嘌呤適體的整體結(jié)構(gòu)包括三個(gè)莖（P1、P2和P3）和兩個(gè)與腺嘌呤結(jié)合的核心區(qū)域，根據(jù)虛線可以分為具有鏡像對(duì)稱的兩部分。每個(gè)核心區(qū)域包含一個(gè)腺嘌呤結(jié)合位點(diǎn)（圖5a，b）。該結(jié)構(gòu)的各個(gè)部分顯示了一個(gè)與茶堿適體一致的配體結(jié)合核心區(qū)域（圖5c，d）。腺嘌呤在第三平面上形成廣泛的氫鍵相互作用，嘌呤環(huán)的N1和N3接受T17 N3和T22 N3的氫鍵，而N6和N9分別向T17 O4和T22 O2提供氫鍵（圖5e）。

圖5. 所設(shè)計(jì)的腺嘌呤DNA適體的結(jié)構(gòu)驗(yàn)證

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院林曉偉、黃園尹和中山大學(xué)藥學(xué)院黃錦超為論文共同第一作者。中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院黃林研究員與黃健教授、廣州實(shí)驗(yàn)室苗智超研究員和中山大學(xué)藥學(xué)院陳碩斌教授為論文共同通訊作者。

本團(tuán)隊(duì)正在招聘博士后若干名，要求是已獲得（或即將獲得）生物學(xué)或醫(yī)學(xué)尤其是適配體篩選與應(yīng)用、酶學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)或結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方向的博士學(xué)位。感興趣的申請(qǐng)人可將個(gè)人的完整簡(jiǎn)歷（如果有論文發(fā)表，請(qǐng)附全文）以及其它相關(guān)資料以PDF格式發(fā)送至huanglin36@mail.sysu.edu.cn.