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傳統(tǒng)光動(dòng)力治療（PDT）受限于II型光敏劑的氧依賴性機(jī)制（需持續(xù)O?供應(yīng)生成單線態(tài)氧）、腫瘤細(xì)胞凋亡抵抗以及乏氧誘導(dǎo)的免疫抑制微環(huán)境，導(dǎo)致對(duì)缺氧實(shí)體瘤療效顯著降低。本研究通過硒摻雜-乙基修飾的分子工程策略，創(chuàng)新性地開發(fā)了一種近紅外生物光催化劑EBSe，EBSe對(duì)4T1細(xì)胞具有顯著的光毒性（>2500倍于亞甲藍(lán)MB）和優(yōu)異的光毒性指數(shù)（PI, >32000）。EBSe表現(xiàn)出自適應(yīng)的光動(dòng)力過程，即在常氧下產(chǎn)生增強(qiáng)的I型/II型ROS，在乏氧時(shí)產(chǎn)生活潑的碳自由基。更重要的是，EBSe顯示出更高的細(xì)胞攝取，并經(jīng)歷光誘導(dǎo)從溶酶體向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，以此激活鐵死亡、細(xì)胞焦亡和脹亡，這三種非凋亡途徑的協(xié)同作用增強(qiáng)了荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫效應(yīng)。這項(xiàng)工作為開發(fā)強(qiáng)大的光敏劑（PSs）提供了一種可靠的策略，以克服實(shí)體腫瘤由于缺氧導(dǎo)致的凋亡抵抗和免疫抑制微環(huán)境。

圖1.（a) EBSe的設(shè)計(jì)策略及自適應(yīng)光催化過程；(b) EBSe的作用機(jī)制及免疫激活過程

團(tuán)隊(duì)的設(shè)計(jì)思路是對(duì)亞甲藍(lán)（MB）進(jìn)行簡(jiǎn)單修飾，利用硒取代提高光敏劑的系間穿越速率增強(qiáng)三重態(tài)量子產(chǎn)率，同時(shí)將甲基換成乙基提高光敏劑親脂性增強(qiáng)細(xì)胞攝取，希望通過兩種修飾協(xié)同作用提高M(jìn)B的光動(dòng)力性能。作者設(shè)計(jì)了四種光敏劑（MB、EB、MBSe 和 EBSe）并對(duì)其光物理/光化學(xué)特性進(jìn)行了測(cè)試和系統(tǒng)性的構(gòu)效關(guān)系研究。在甲醇中，EBSe的吸收和發(fā)射光譜（λ_ex = 662 nm，λ_em = 694 nm）相較于MB（λ_ex = 652 nm，λ_em = 680 nm）略有紅移。此外，EB與EBSe的摩爾消光系數(shù)明顯高于MB和MBSe，且具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性。EB和EBSe的LogP值明顯高于甲基取代衍生物MB和MBSe，這與EB和EBSe在PBS溶液中形成更多的H-二聚體的現(xiàn)象相一致。上述結(jié)果可能歸因于二乙胺基相較于二甲胺基具有更強(qiáng)的給電子能力及更高的親脂性。MBSe與EBSe的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率分別達(dá)到85%和81%，遠(yuǎn)高于MB（52%）和EB（57%）。這些結(jié)果主要?dú)w因于重原子Se的引入提高了系間竄越（ISC）效率。此外，密度泛函理論（DFT）計(jì)算結(jié)果進(jìn)一步顯示EBSe相比MB具有明顯更大的自旋軌道耦合（SOC）常數(shù)及更高的系間竄越速率。本研究還評(píng)估了四種光敏劑在PBS（pH = 7.4）溶液中的I型ROS生成能力，結(jié)果表明，EBSe在O₂^?- 和?OH的生成能力上均表現(xiàn)出最優(yōu)異的性能。隨后，采用電子自旋共振（EPR）測(cè)量了各化合物光誘導(dǎo)的ROS生成能力。相較于MB、EB和MBSe，EBSe顯示出最高的活性氧EPR信號(hào)。同時(shí)，在常氧條件下，EBSe在PBS溶液中表現(xiàn)出最強(qiáng)的?OH信號(hào)，并伴隨有明顯的碳中心自由基信號(hào)，在缺氧條件下（氧濃度<1%，真空手套箱中），水溶液中碳自由基的EPR信號(hào)占據(jù)主導(dǎo)地位。值得注意的是，在缺氧條件下EBSe產(chǎn)生的碳自由基信號(hào)相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)溶液重新暴露于空氣中時(shí)，這些碳自由基能夠逐漸轉(zhuǎn)化為O₂^?-和?OH。此外，在近紅外（NIR）照射下，四種光敏劑均能夠光氧化NADH和四氫蝶呤（BH₄），其中EBSe表現(xiàn)出最高的氧化效率。

基于以上研究，團(tuán)隊(duì)提出了EBSe（EBSe⁺）的光催化作用機(jī)制：在近紅外光激發(fā)下，EBSe從基態(tài)躍遷至單重激發(fā)態(tài)（¹EBSe^+*），¹EBSe^+*通過系間竄越到三重激發(fā)態(tài)（³EBSe^+*）。在常氧條件下，³EBSe^+*可以將能量轉(zhuǎn)移給周圍的氧分子生成單線態(tài)氧（¹O₂）。與此同時(shí)，由于EBSe比MB具有更高的親脂性并更易形成H-聚集體，使得³EBSe^+*能夠與基態(tài)分子EBSe⁺進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移生成EBSe^2+?和EBSe?，納秒和飛秒級(jí)瞬態(tài)吸收泵浦探測(cè)光譜也驗(yàn)證了該類碳自由基的存在。在細(xì)胞環(huán)境中，³EBSe^+*可以從NADH等還原性生物分子中獲得電子，從而在無氧條件下產(chǎn)生EBSe?， EBSe?可進(jìn)一步還原氧分子生成O₂^?-和?OH。循環(huán)伏安法顯示EBSe⁺/EBSe?的還原電位（-0.72 V vs NHE）比O₂/O₂^?-（-0.33 V vs NHE）和O₂/?OH（0.31 V vs NHE，pH = 7.0）更負(fù)。這些結(jié)果表明EBSe具有自適應(yīng)光催化特性，在常氧和缺氧條件下均能產(chǎn)生具有細(xì)胞殺傷作用的ROS和碳自由基。

圖2.(a) 硒摻雜-乙基修飾的分子工程策略設(shè)計(jì)EBSe; (b)光催化過程；(c) 吸收/發(fā)射光譜；(d-f) ¹O₂、O₂^?-與?OH的檢測(cè)；（g-j）常氧或乏氧下各化合物產(chǎn)生ROS以及碳自由基的EPR圖譜；(K) 從乏氧到常氧環(huán)境下，碳自由基轉(zhuǎn)換成ROS的時(shí)間依賴圖；(l) 光催化NADH比較圖；(m) 各光敏劑循環(huán)伏安圖。

四種光敏劑（MB、EB、MBSe 和 EBSe）對(duì)4T1細(xì)胞均表現(xiàn)出極低的暗毒性（IC₅₀ > 512 μM），說明對(duì)MB進(jìn)行的微小結(jié)構(gòu)修飾保持了優(yōu)異的生物安全性。在660 nm光照下，MB在常氧條件下表現(xiàn)出微弱光毒性（IC₅₀ = 9.2 μM），但在缺氧條件下光毒性顯著降低（IC₅₀ = 40.2 μM）。而EBSe在常氧（IC₅₀ = 0.014 μM）和缺氧條件下（IC₅₀ = 0.016 μM）均表現(xiàn)出極其優(yōu)異的光毒性。與MB相比，EBSe在缺氧條件下對(duì)4T1細(xì)胞光毒性的提高超過了2500倍，對(duì)氧氣依賴性極低，且光毒性指數(shù)PI（即暗毒性與光毒性之比）在常氧條件下超過36000，在缺氧條件下超過32000。這些結(jié)果表明，引入硒原子或乙基這兩種修飾所產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)極大地提高了PDT性能。

為了深入探討EBSe顯著提升PDT性能的機(jī)制，團(tuán)隊(duì)對(duì)4T1細(xì)胞中的光敏劑攝取情況以及其引起的細(xì)胞損傷進(jìn)行了詳細(xì)研究。因具有更高的LogP值，乙基取代的EB和EBSe的細(xì)胞攝取效率顯著高于相應(yīng)的甲基取代衍生物，且EBSe通過質(zhì)子泵及胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。通過共聚焦細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可知，EBSe在光照條件下以非氧依賴方式高效殺傷4T1細(xì)胞，而MB在缺氧條件下的殺傷效果則明顯降低。隨后，通過激光共聚焦熒光成像進(jìn)一步研究了EBSe的亞細(xì)胞定位。在未進(jìn)行光照前，EBSe主要富集在溶酶體（PCC=0.85），在光照處理后，EBSe與LysoTracker染色圖像的重疊度顯著降低（PCC=0.20），同時(shí)與Hoechst 33342細(xì)胞核的染色（PCC=0.72）顯著增加。這些結(jié)果表明，EBSe在光照下能夠嚴(yán)重?fù)p傷溶酶體，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，對(duì)核酸造成直接損傷。同樣地，MBSe、MB和EB在10分鐘光照處理后也出現(xiàn)了類似從溶酶體遷移至細(xì)胞核的現(xiàn)象。同時(shí)，EBSe在無氧條件下可直接有效地造成DNA損傷。綜上所述，EBSe在NIR光照下可引起溶酶體及細(xì)胞核的級(jí)聯(lián)損傷效應(yīng)。

圖3.(a) EBSe在近紅外光誘導(dǎo)下從溶酶體向細(xì)胞核的遷移示意圖；(b) 細(xì)胞攝取效率；(c) 細(xì)胞內(nèi)O₂^?-及ROS檢測(cè)共聚焦圖；(d) 活死細(xì)胞染色共聚焦圖；(e) 光誘導(dǎo)EBSe在細(xì)胞內(nèi)遷移共聚焦圖；(f-g) 細(xì)胞器共定位圖及共定位系數(shù)；(h) 添加不同濃度的DNA片段后EBSe的吸收光譜; (i) 細(xì)胞中DNA損傷特征蛋白γ-H2AX水平的WB印跡分析；(j) 凝膠電泳檢測(cè)EBSe在光照射后對(duì)DNA的光氧化損傷。

為了進(jìn)一步探索EBSe從溶酶體向細(xì)胞核遷移所引起的一系列效應(yīng)，團(tuán)隊(duì)選擇MB作為對(duì)照化合物進(jìn)行了深入探索。研究發(fā)現(xiàn)，EBSe以較低濃度即可引起溶酶體膜通透性（LMP）增加，以及胞內(nèi)H⁺與Fe²⁺顯著升高，同時(shí)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4，一種關(guān)鍵的鐵死亡抑制蛋白）和谷胱甘肽（GSH，胞內(nèi)抗氧化劑）水平明顯下調(diào)。以上結(jié)果表明EBSe光誘導(dǎo)了細(xì)胞鐵死亡。同時(shí)焦亡抑制劑四乙基秋蘭姆二硫化物（TETD）也能部分恢復(fù)EBSe光照處理的細(xì)胞存活率，表明細(xì)胞也發(fā)生了焦亡途徑，即caspase-1及GSDMD表達(dá)下降，而GSDMD-N片段表達(dá)顯著增加。同時(shí)，EBSe⁺光照處理細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中IL-1β、IL-18細(xì)胞因子水平明顯升高，ATP和乳酸脫氫酶（LDH）釋放也顯著增加。此外，TEM及熒光成像發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EBSe⁺光照處理后的細(xì)胞表現(xiàn)出典型的腫脹死亡形態(tài)特征，包括線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、染色質(zhì)異常凝聚和胞質(zhì)空泡化。受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子導(dǎo)致胞質(zhì)鈣水平升高，光照處理后線粒體膜電位顯著下降，胞內(nèi)ATP水平也顯著降低，表明線粒體功能受損、氧化磷酸化受到抑制。Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)EBSe光照處理后的細(xì)胞中，脹亡的標(biāo)志性跨膜蛋白Porimin表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)線粒體鈣蛋白酶1（calpain 1）也明顯激活，而促凋亡蛋白Bax則受到顯著抑制，導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值升高，凋亡途徑受抑制。以上結(jié)果充分表明，EBSe產(chǎn)生的PDT效應(yīng)能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡、焦亡和脹亡多種非凋亡細(xì)胞死亡途徑，有效克服缺氧腫瘤的凋亡耐受性，并顯著激活針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。

圖4. (a) EBSe的PDT過程誘導(dǎo)多種細(xì)胞死亡途徑示意圖；(b-d) EBSe光誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡相關(guān)驗(yàn)證；(e-h) EBSe光誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡相關(guān)驗(yàn)證；(i-o) EBSe光誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生脹亡相關(guān)驗(yàn)證。

基于EBSe在體外PDT實(shí)驗(yàn)中優(yōu)異的抗癌細(xì)胞性能，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步在4T1荷瘤小鼠模型中評(píng)價(jià)了其體內(nèi)抗腫瘤光療和協(xié)同免疫治療效果。首先，根據(jù)活體成像系統(tǒng)（IVIS）檢測(cè)了瘤內(nèi)注射MB和EBSe的熒光信號(hào)變化，以確定給藥和光照時(shí)間?！癊BSe+光照”組小鼠腫瘤體積明顯小于其他組，腫瘤抑制率（TGI）達(dá)到72.4%，而“MB+光照”組的TGI僅為34.0%，證明EBSe介導(dǎo)的PDT對(duì)于缺氧腫瘤的生長(zhǎng)抑制更為有效。隨后，團(tuán)隊(duì)在雙側(cè)皮下種植4T1腫瘤的小鼠模型中評(píng)價(jià)了EBSe和MB的光誘導(dǎo)腫瘤免疫治療效果。經(jīng)過兩周光照治療后，EBSe組小鼠腫瘤體積顯著減少，其中原發(fā)瘤和遠(yuǎn)端瘤的腫瘤抑制率分別達(dá)到68.2%和75.6%。相比之下，MB組對(duì)原發(fā)瘤和遠(yuǎn)端瘤的腫瘤抑制率分別僅為38.2%和25.5%。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，EBSe處理組小鼠淋巴結(jié)中成熟樹突狀DCs細(xì)胞（CD11c/MHC II）比例達(dá)到40.19%，比MB組和PBS組分別提高了3.4倍和3.7倍；EBSe組中毒性T淋巴細(xì)胞（CD8⁺）細(xì)胞占比達(dá)10.44%，輔助性T細(xì)胞（CD4⁺）占比則從PBS組的7.89%提升至23.14%，MB組為13.17%。此外，小鼠血清炎癥因子檢測(cè)顯示，EBSe組促炎因子（TNF-α、IFN-γ和IL-6）表達(dá)升高，而抑制性因子IL-10則明顯下降。以上結(jié)果表明，EBSe可光消融缺氧腫瘤并激活系統(tǒng)免疫反應(yīng)方面明顯優(yōu)于MB，為缺氧腫瘤的治療提供了一種高效策略。

圖5.(a-b) 體內(nèi)抗腫瘤PDT和免疫反應(yīng)評(píng)估示意圖；(c) 治療和手術(shù)切除后原發(fā)性和遠(yuǎn)端腫瘤的照片；(d-e) PDT治療期間和治療后原發(fā)性和遠(yuǎn)端腫瘤的體積和重量；(f-g) PDT治療后不同組小鼠腫瘤和淋巴結(jié)中免疫指標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

總之，本研究構(gòu)建了一種非氧依賴型的光敏劑EBSe，EBSe可通過近紅外光照射誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡、焦亡和脹亡，有效激活針對(duì)乏氧腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。對(duì)亞甲藍(lán)（MB）進(jìn)行簡(jiǎn)單的硒取代和乙基化修飾，使EBSe具備了更高的三重態(tài)量子產(chǎn)率和親脂性，從而在缺氧條件下對(duì)4T1細(xì)胞表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的光毒性（提高>2500倍）以及極高的光毒性指數(shù)（PI>32000）。EBSe具有自適應(yīng)光催化能力，即在常氧條件下能高效地產(chǎn)生Ⅰ型/Ⅱ型ROS，而在缺氧條件下產(chǎn)生碳自由基。此外，EBSe主要富集于溶酶體，并在光照作用下引發(fā)溶酶體功能障礙與膜通透性增加，隨后遷移至細(xì)胞核，造成DNA損傷。這些由PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞器損傷激活了包括焦亡、鐵死亡及脹亡在內(nèi)的多種非凋亡細(xì)胞死亡通路，協(xié)同誘發(fā)了4T1荷瘤小鼠強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)。本研究為開發(fā)高性能、臨床轉(zhuǎn)化潛力的缺氧腫瘤光催化劑提供了可靠的策略，同時(shí)也為其他光催化領(lǐng)域的應(yīng)用提供了重要的參考價(jià)值。

南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院博士后姚善昆與博士研究生徐風(fēng)梧為論文共同第一作者，指導(dǎo)老師為陳韻聰教授、何衛(wèi)江教授和郭子建教授。作者特別感謝南京林業(yè)大學(xué)的劉志鵬教授與湖州師范學(xué)院的尚積禎教授，以及參與該工作的同學(xué)所提供的幫助。

郭子建，博士生導(dǎo)師，中國(guó)科學(xué)院院士，英國(guó)皇家化學(xué)會(huì)會(huì)士?，F(xiàn)任南京大學(xué)化學(xué)和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院院長(zhǎng)，南京大學(xué)新生學(xué)院院長(zhǎng)，南京大學(xué)學(xué)術(shù)委員會(huì)副主任，配位化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南京大學(xué)）學(xué)委會(huì)副主任，國(guó)務(wù)院學(xué)位委員會(huì)學(xué)科評(píng)議組（化學(xué)）成員，教育部科技委員會(huì)委員化學(xué)化工學(xué)部委員，中國(guó)化學(xué)會(huì)常務(wù)理事。Chemical & Biomedical Imaging期刊創(chuàng)刊主編，曾擔(dān)任愛思唯爾Coord. Chem. Rev.副主編，中國(guó)化學(xué)會(huì)《無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)》主編，以及Nat. Sci. Rev., Dalton Trans等國(guó)內(nèi)外多家學(xué)術(shù)期刊編委或顧問編委等。曾主持多項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目，科技部973計(jì)劃重大科學(xué)前沿領(lǐng)域項(xiàng)目（首席科學(xué)家），國(guó)家自然科學(xué)基金委創(chuàng)新群體（學(xué)術(shù)帶頭人），得到國(guó)家基金委化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域首個(gè)重大研究計(jì)劃培育、集成及擇優(yōu)項(xiàng)目的連續(xù)資助以及多項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目。曾獲教育部2015年度自然科學(xué)一等獎(jiǎng)，意大利化學(xué)會(huì)2016年度Luigi Sacconi獎(jiǎng)?wù)拢?020年度“亞洲生物無機(jī)化學(xué)學(xué)會(huì)杰出成就獎(jiǎng)”等獎(jiǎng)項(xiàng)。團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期從事化學(xué)生物學(xué)交叉領(lǐng)域研究，在生物無機(jī)傳感與成像示蹤、金屬抗腫瘤藥物的分子作用機(jī)制與靶向輸運(yùn)及金屬免疫學(xué)等方面取得了系列創(chuàng)新性研究成果，已發(fā)表SCI論文480余篇，被引用2.9萬次，H指數(shù)84。

陳韻聰，教授，博士生導(dǎo)師。分別于2008年、2014年在南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院獲得學(xué)士和博士學(xué)位，導(dǎo)師郭子建教授。2014年8月至2018年7月，香港科技大學(xué)唐本忠教授課題組從事博士后研究。2018年9月至2022年12月任南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院副教授，2023年1月任教授。迄今已在Chem. Soc. Rev.; Nat. Commun.; J. Am. Chem. Soc.; Angew. Chem. Int. Ed.等雜志上發(fā)表SCI文章120余篇。文章總引用7500余次，單篇最高引用750余次，H-index 43, 獲授權(quán)發(fā)明專利6項(xiàng)。2021年獲國(guó)家自然科學(xué)基金委優(yōu)秀青年進(jìn)項(xiàng)目資助，曾獲得江蘇省優(yōu)秀博士學(xué)位論文等榮譽(yù)，目前任Frontiers in Chemistry, Frontiers in Chemical Biology期刊副主編，Wiley旗下Luminescence期刊副主編，Chemical & Biomedical Imaging等期刊青年編委。

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