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Angew|中國(guó)藥大董廖斌組聯(lián)合復(fù)旦李付琸組開發(fā)微生物工程策略高產(chǎn)手性砌塊,實(shí)現(xiàn)雜萜天然產(chǎn)物的簡(jiǎn)潔合成

來源:中國(guó)藥科大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)      2025-01-14
導(dǎo)讀:近日,中國(guó)藥科大學(xué)董廖斌課題組聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)李付琸課題組在微生物工程助力雜萜天然產(chǎn)物高效合成領(lǐng)域取得重要突破。該團(tuán)隊(duì)通過系統(tǒng)的代謝工程和酶工程策略,成功突破了關(guān)鍵手性砌塊的規(guī)?;苽淦款i,將drimane型手性砌塊的微生物發(fā)酵產(chǎn)量提升至克級(jí)水平。基于獲得的手性砌塊,團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了多個(gè)具有生物活性的雜萜天然產(chǎn)物的高效簡(jiǎn)潔合成。該研究成果以"Microbe Engineering to Provide Drimane-Type Building Blocks for Chiral Pool Synthesis of Meroterpenoids"為題發(fā)表在國(guó)際知名期刊Angewandte Chemie International Edition上(https://doi.org/10.1002/anie.202419463)。

正文

雜萜天然產(chǎn)物是一類結(jié)構(gòu)多樣、生物活性廣泛的復(fù)雜天然產(chǎn)物,目前已發(fā)現(xiàn)超過500個(gè)化合物(圖1A)。其中,pyripyropene C對(duì)?;o酶A膽固醇?;D(zhuǎn)移酶(ACAT)表現(xiàn)出強(qiáng)效的抑制活性(IC5053 nM),zonarol (1)具有神經(jīng)保護(hù)作用,ent-(+)-chromazonarol (2)是一個(gè)針對(duì)農(nóng)作物病原菌的潛在防治藥物,mycoleptodiscin A (3)表現(xiàn)出中等的抗菌活性,而pelorol (4)對(duì)真菌表現(xiàn)出優(yōu)異的抑制活性(EC507.7 μM)。這些化合物均以drimane骨架(藍(lán)色標(biāo)注部分)與非萜類部分形成獨(dú)特的雜合結(jié)構(gòu),在藥物開發(fā)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面展現(xiàn)出良好的開發(fā)潛力,然而其高效合成一直是一個(gè)重要挑戰(zhàn)。

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圖1. 雜萜天然產(chǎn)物及其合成策略. (A) Drimane骨架及代表性的含drimane骨架雜萜天然產(chǎn)物(DMT),包括pyripyropene C、zonarol (1)、ent-(+)-chromazonarol (2)、mycoleptodiscin A (3)和pelorol (4),其中drimane核心結(jié)構(gòu)以藍(lán)色標(biāo)示; (B) DMT的傳統(tǒng)合成策略,包括側(cè)鏈降解手性合成子法和立體選擇性多環(huán)化法; (C) 本研究開發(fā)的結(jié)合微生物工程和化學(xué)合成的集成策略用于DMT的簡(jiǎn)潔合成。

傳統(tǒng)的雜萜天然產(chǎn)物合成策略主要依賴兩種方法(圖1B):立體選擇性多環(huán)化和手性合成子法。立體選擇性多環(huán)化方法往往步驟冗長(zhǎng),且在關(guān)鍵的生物模擬環(huán)化步驟中立體選擇性難以控制。而手性合成子法雖然立體化學(xué)明確,但主要依賴植物來源的香紫蘇內(nèi)酯或香紫蘇醇作為起始原料,需要3-6步的側(cè)鏈降解反應(yīng)才能獲得目標(biāo)C15中間體,這不僅降低了原子經(jīng)濟(jì)性,也影響了整體合成效率。

近年來,研究發(fā)現(xiàn)drimenol (5)albicanol (6)這類drimane型化合物可以作為替代性手性砌塊,它們能夠與芳基鹵代物直接偶聯(lián),無需碳鏈降解過程,為雜萜天然產(chǎn)物提供了更為簡(jiǎn)潔的合成途徑。然而,這些C15化合物在自然界中含量極其有限,且以往報(bào)道的異源生產(chǎn)方法產(chǎn)量普遍較低,例如在煙草葉片中表達(dá)PhDS基因獲得的drimenol產(chǎn)量?jī)H為392 μg/g鮮重,而在酵母中生產(chǎn)albicanol需要4L培養(yǎng)基和96小時(shí)發(fā)酵才能獲得8.3 mg產(chǎn)物。這種低效的生產(chǎn)方式嚴(yán)重限制其作為手性砌塊的進(jìn)一步開發(fā)。

面對(duì)這一關(guān)鍵瓶頸問題,研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了綜合的微生物工程策略(圖1C)。該策略首先利用“人工兩步法”PhoN-IPK系統(tǒng)來提供萜類前體,這一系統(tǒng)可以將外源添加的五碳醇DMAA/ISO直接轉(zhuǎn)化為五碳焦磷酸前體IPPDMAPP顯著簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)MVAMEP途徑(圖1C)。在此基礎(chǔ)上,團(tuán)隊(duì)通過兩個(gè)關(guān)鍵策略來提升目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量:策略1引入生物合成通路中Nudix水解酶從而提高產(chǎn)物滴度;策略2則通過對(duì)PhoN-IPK系統(tǒng)中關(guān)鍵磷酸化酶PhoN進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和改造從而提高底物轉(zhuǎn)化效率。

在初始階段,研究團(tuán)隊(duì)首先對(duì)drimenol合酶進(jìn)行篩選(圖2A)。通過對(duì)比SsDMS、ScDMSCavC三個(gè)來源不同的drimenol合酶,發(fā)現(xiàn)它們的產(chǎn)量差異并不顯著(13-15 mg/L)。由于II型萜類環(huán)化酶產(chǎn)生的中間產(chǎn)物帶有焦磷酸基團(tuán),研究人員猜測(cè)大腸桿菌內(nèi)源水解酶的低效率可能是限制產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。進(jìn)一步對(duì)drimenol生物合成基因分析發(fā)現(xiàn)SsDMS上游存在Nudix水解酶(SsNDH)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),引入SsNDH后產(chǎn)量顯著提升至63 mg/L。

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圖2. Drimenol生產(chǎn)的優(yōu)化策略. (A) 三種不同來源的細(xì)菌drimenol合酶產(chǎn)量比較; (B) SsNDH-SsDMS融合蛋白構(gòu)建示意圖。單酶、分離酶單元和具有不同長(zhǎng)度linker的融合蛋白(n=0-4),插圖顯示了連接linker的組成; (C) 不同酶排列方式和融合構(gòu)建體(n=0-4)對(duì)drimenol產(chǎn)量的優(yōu)化; (D) 優(yōu)化后的SsNDH-SsDMS融合蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型,其中SsNDH(粉色)通過柔性linker(藍(lán)色)與SsDMS(橙色,顯示β和γ亞基)相連。

為了進(jìn)一步優(yōu)化催化效率,團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了不同的酶表達(dá)方式(圖2B)。考慮到空間鄰近性可能有助于底物傳遞,研究人員構(gòu)建了SsNDH-SsDMS融合蛋白。通過AlphaFold2預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)顯示,兩個(gè)酶的活性位點(diǎn)可以通過柔性linker連接實(shí)現(xiàn)良好的空間布局。在對(duì)linker長(zhǎng)度進(jìn)行優(yōu)化后(圖2C),產(chǎn)量進(jìn)一步提升至111 mg/L。預(yù)測(cè)的融合蛋白結(jié)構(gòu)(圖2D)清晰地展示了SsNDH(粉色)和SsDMS(橙色)通過柔性linker(藍(lán)色)形成的空間排布。

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圖3. PhoN的工程改造. (A) 含活性位點(diǎn)口袋的PhoN同源模型。插圖:與DMAP相距4?內(nèi)的關(guān)鍵殘基; (B) 圖A中選定殘基的丙氨酸掃描結(jié)果; (C) 電荷改變突變的靜電表面修飾,野生型vs突變體; (D) 帶電突變對(duì)產(chǎn)量的影響; (E) 按進(jìn)化保守性著色的PhoN表面展示圖; (F) PhoN同源序列的序列標(biāo)識(shí),方框內(nèi)標(biāo)出突變靶點(diǎn); (G) 基于保守性指導(dǎo)的突變對(duì)產(chǎn)量的影響。

盡管通過融合蛋白策略顯著提升了產(chǎn)量,但111 mg/L的產(chǎn)量仍難以滿足實(shí)際應(yīng)用需求。團(tuán)隊(duì)注意到在整個(gè)反應(yīng)過程中,PhoN催化的可逆磷酸化和水解反應(yīng)可能是另一個(gè)關(guān)鍵的限速步驟。通過結(jié)構(gòu)分析(圖3A)發(fā)現(xiàn),PhoN的活性位點(diǎn)由K133、R140S166、G167、H168、R201、H207D211等殘基組成。對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行丙氨酸掃描發(fā)現(xiàn)突變后產(chǎn)物幾乎完全喪失(圖3B,證實(shí)了這些位點(diǎn)的重要性。

基于PhoN催化可逆磷酸化反應(yīng)的特點(diǎn),研究團(tuán)隊(duì)提出了一個(gè)提高催化效率的新思路:通過在活性口袋附近引入正電荷,增強(qiáng)酶與磷酸基團(tuán)的相互作用。通過對(duì)DMAPPhoN的分子對(duì)接實(shí)驗(yàn),團(tuán)隊(duì)選擇了位于配體4?范圍內(nèi)的E122G125、L158I171進(jìn)行定點(diǎn)突變。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示(圖3C),在不同位點(diǎn)引入精氨酸或賴氨酸會(huì)產(chǎn)生不同的效果:E122R/K突變?cè)诘孜镞M(jìn)入的關(guān)鍵位置顯著增加了正電荷,而G125R/K突變雖然增加了電荷但可能會(huì)阻礙活性口袋,L158I171作為內(nèi)部殘基,帶電突變對(duì)口袋表面電荷的影響較小。隨后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全符合這一預(yù)測(cè):E122R突變使產(chǎn)量提升至178 mg/L(提高1.6倍),而G125R/K變體產(chǎn)量嚴(yán)重下降(分別為179 mg/L),L158I171位點(diǎn)的突變也導(dǎo)致產(chǎn)量顯著降低(均低于10 mg/L)。這種將結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的系統(tǒng)方法,清楚地證明了在活性口袋附近戰(zhàn)略性地引入正電荷可以顯著提高磷酸化效率。

為了進(jìn)一步優(yōu)化PhoN催化效率,團(tuán)隊(duì)轉(zhuǎn)向了進(jìn)化分析策略。通過分析500個(gè)與PhoN序列相似度超過80%的酸性磷酸酶序列,利用EMBL-MUSCLE進(jìn)行多序列比對(duì)和ConSurf WEB SERVER進(jìn)行保守性分析,將氨基酸殘基按保守程度分為九個(gè)等級(jí)(圖3E)。在距離活性口袋12?范圍內(nèi),團(tuán)隊(duì)識(shí)別出六個(gè)非保守殘基:S90、Y135K153、T157、R160I222(圖3E-F)。這些殘基在進(jìn)化過程中表現(xiàn)出較高的可變性,暗示它們可能是潛在的優(yōu)化靶點(diǎn)。通過將這些非保守殘基替換為更具保守性的氨基酸,團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了十個(gè)PhoN變體。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)顯示,S90G、T157KR160K突變使drimenol產(chǎn)量較野生型提高了約1.2倍。這一結(jié)果表明,在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中,這個(gè)酶家族確實(shí)傾向于進(jìn)化出更穩(wěn)定和更高效的形式。

為可喜的是,當(dāng)將帶電突變(E122R)與進(jìn)化分析獲得的有益突變(T157KR160K合時(shí),產(chǎn)生了顯著的協(xié)同效應(yīng)。最優(yōu)的三突變體E122R/T157K/R160K使drimenol產(chǎn)量達(dá)到了398 mg/L,較初始產(chǎn)量提升了27倍。為了解釋這種顯著提升的分子機(jī)制,團(tuán)隊(duì)成功解析了PhoNE122R/T157K/R160K的晶體結(jié)構(gòu)(PDB: 8YC1,圖4B-C)。與野生型PhoN相比,三突變體的等電點(diǎn)從6.08升至7.72,表明表面正電荷顯著增加。更重要的是,分子動(dòng)力學(xué)模擬(圖4D)揭示突變體能夠與配體維持長(zhǎng)達(dá)40 ns的穩(wěn)定相互作用,相比于野生型PhoN穩(wěn)定作用時(shí)間延長(zhǎng)了近20 ns這可能是其催化效率提升的關(guān)鍵原因。

在取得drimenol生產(chǎn)的重要突破后,研究團(tuán)隊(duì)開始評(píng)估其在合成中的應(yīng)用。然而,在初步嘗試drimenol碘代物與芳基碘代物的鎳催化還原偶聯(lián)反應(yīng)時(shí),由于β-H消除反應(yīng)的發(fā)生,主要得到二烯產(chǎn)物。這一結(jié)果促使團(tuán)隊(duì)轉(zhuǎn)向探索albicanol,其碘代物在Weix條件下能夠與不同的芳基鹵代物順利發(fā)生偶聯(lián)。基于這一設(shè)想,研究團(tuán)隊(duì)將優(yōu)化后的PhoN-IPK系統(tǒng)應(yīng)用于albicanol的生產(chǎn)。通過將SsDMS替換為來自Antrodia cinnamomea的環(huán)化酶AncC,初始產(chǎn)量即達(dá)到281 mg/L。

為了進(jìn)一步提高albicanol的產(chǎn)量,研究團(tuán)隊(duì)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。通過調(diào)控IPTG濃度(0.05 mM)、甘油濃度(2%),以及優(yōu)化ISO的添加策略,在搖瓶水平將albicanol產(chǎn)量提升至1805 mg/L。更為重要的是,在5L發(fā)酵罐中采用階段補(bǔ)料策略,即在OD600達(dá)到30時(shí)開始補(bǔ)料,當(dāng)albicanol達(dá)到1.6 g/L時(shí)追加8 g ISO,最終使產(chǎn)量提升至3.5 g/L(圖4E),創(chuàng)造了微生物發(fā)酵生產(chǎn)albicanol的最高水平。

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圖4. PhoNE122R/T157K/R160K的結(jié)構(gòu)分析和albicanol生產(chǎn)優(yōu)化. (A) 策略1和策略2中突變組合對(duì)drimenol產(chǎn)量的影響; (B) PhoNE122R/T157K/R160K的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:8YC1); (C) 野生型PhoN(灰色)和PhoNE122R/T157K/R160K(藍(lán)色)的結(jié)構(gòu)比對(duì)。插圖:與DMAP作用的突變殘基; (D) 野生型PhoN和PhoNE122R/T157K/R160K與DMAP的分子動(dòng)力學(xué)模擬,顯示RMSD值; (E) Albicanol發(fā)酵過程曲線,顯示OD600、葡萄糖消耗和albicanol產(chǎn)量隨時(shí)間的變化。插圖:albicanol結(jié)構(gòu)。

有了充足的drimane手性砌塊供應(yīng)后,研究團(tuán)隊(duì)開始探索其在雜萜類天然產(chǎn)物合成中的應(yīng)用。團(tuán)隊(duì)通過鎳催化的還原偶聯(lián)反應(yīng)(圖5A),建立了一系列雜萜類化合物的簡(jiǎn)潔合成路線(圖5B)。這包括zonarol (1)3步合成(總收率66%),ent-(+)-chromazonarol (2)4步合成(總收率65%),mycoleptodiscin A (3)6步合成(總收率22%),以及pelorol (4)6步合成(總收率14%)。

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圖5. 以albicanol為手性砌塊的DMT發(fā)散合成. (A) Albicanol (6)與芳基鹵代物(8)的鎳催化還原偶聯(lián)反應(yīng); (B) Zonarol (1)、ent-(+)-chromazonarol (2)、mycoleptodiscin A (3)和pelorol (4)的手性合成子合成路線。

總結(jié)

中國(guó)藥科大學(xué)董廖斌課題組聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)李付琸課題組針對(duì)雜萜類天然產(chǎn)物簡(jiǎn)潔高效合成題,創(chuàng)新性地將微生物工程與化學(xué)合成相結(jié)合,建立了一套完整的交叉學(xué)科技術(shù)體系。研究團(tuán)隊(duì)通過系統(tǒng)的酶工程改造和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究,成功突破了手性砌塊規(guī)?;苽涞钠款i,在分子水平闡明了人工兩步法體系中酸性磷酸酶的催化機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)不僅為后續(xù)開發(fā)更高效的drimane型手性砌塊生物合成體系提供了理論基礎(chǔ),也為解決其他萜類化合物的生產(chǎn)難題提供了新思路。更重要的是,該研究為天然產(chǎn)物全合成領(lǐng)域提供新穎的研究范式:通過微生物工程獲取關(guān)鍵手性砌塊,繼而通過靈活的化學(xué)轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的高效簡(jiǎn)潔合成。這種策略避免了傳統(tǒng)全生物合成中需要組裝復(fù)雜酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)的困難,同時(shí)也克服了有機(jī)全合成中手性源獲取困難和步驟冗長(zhǎng)的問題,將顯著加速雜萜類生物活性分子的發(fā)現(xiàn)和藥物開發(fā)進(jìn)程。

文獻(xiàn)詳情:

Microbe engineering to provide drimane-type building blocks for chiral pool synthesis of meroterpenoids. 
Wenyu Du, Zhongyu Cheng, Xingming Pan, Chenhao Liu, Mingyu Yue, Tianhao Li, Zhixi Xiao, Lu-Lu Li, Xuelan Zeng, Xiaoxu Lin, Prof. Fuzhuo Li, Prof. Liao-Bin Dong
Angew. Chem. Int. Ed. 2025
https://doi.org/10.1002/anie.202419463

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