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2024年4月17日國際頂級期刊Nature（《自然》）在線發(fā)表了題為“Digital colloid-enhanced Raman spectroscopy by single-molecule counting”的研究論文。該研究針對表面增強拉曼光譜領(lǐng)域內(nèi)定量的挑戰(zhàn)，系統(tǒng)闡述了基于數(shù)字膠體增強拉曼光譜（digital colloid-enhanced Raman spectroscopy, dCERS）的定量技術(shù)?；趩畏肿佑嫈?shù)，dCERS成功實現(xiàn)了超低濃度目標分子的可靠定量檢測，為表面增強拉曼光譜技術(shù)的普遍應用奠定了重要基礎(chǔ)。

本文的第一作者為上海交通大學生物醫(yī)學工程學院致遠榮譽計劃博士研究生畢心緣，通訊作者為葉堅教授。作為資深作者，邵志峰教授在基本概念、數(shù)據(jù)解析以及文章的凝練、修改等方面做出了關(guān)鍵貢獻。Daniel M. Czajkowsky教授也對數(shù)據(jù)的物理原理與文章修改做出了重要貢獻。上海交通大學是論文的唯一完成單位和通訊單位。

研究背景

拉曼散射（Raman scattering）是Chandrasekhara Venkata Raman于1928年發(fā)現(xiàn)的一種指紋式的、具有分子結(jié)構(gòu)特異性的非彈性散射光譜，并獲得了1930年頒發(fā)的諾貝爾物理學獎。通過拉曼譜峰可以直接判斷對應的分子結(jié)構(gòu)，進而識別具體的分子的類型。該技術(shù)具有無需標記的優(yōu)勢，使其在物理、化學、生物、地質(zhì)、醫(yī)學、國防和公共安全等各個領(lǐng)域均具有重要的應用價值。

拉曼信號通常比較弱，因此信號增強就變得非常有必要。表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS）源于1974年英國南安普敦大學化學系Martin Fleischmann等人的一個重要實驗。他們發(fā)現(xiàn)，在粗糙的銀電極表面所附著的吡啶分子所產(chǎn)生的拉曼散射信號會被極大地增強，其物理原理在1977年分別由美國西北大學化學系David L. Jeanmaire和Richard P. Van Duyne以及英國肯特大學化學實驗室M. Grant Albrecht和J. Alan Creighton從電磁場效應和電荷轉(zhuǎn)移效應做出了解釋。1997年SERS迎來了里程碑的事件——單分子SERS檢測的實現(xiàn)。自此，SERS技術(shù)被認為有希望使得拉曼光譜第二次獲得諾貝爾獎。迄今為止，研究人員開發(fā)了各種不同的納米增強基底，如納米星、納米海膽、納米花、納米森林等，通過采用不同的濕化學合成方案與芯片制造工藝，使得基底表面具有更為豐富的尖端、縫隙結(jié)構(gòu)，形成更強的熱點區(qū)域為其中的分子提供更高的增強能力，實現(xiàn)超低濃度的分子檢測。

但是，隨著SERS研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)在低濃度檢測時，拉曼信號強度存在極大的不可重復性。因此，具有單分子檢測的靈敏度并不意味著超靈敏定量的實現(xiàn)。換言之，獲得更高的增強因子只是實現(xiàn)SERS高靈敏定量檢測的必要條件，而只有實現(xiàn)了具有可重復性的測量，SERS技術(shù)才具有實際應用與大規(guī)模推廣的能力。很顯然，這一困擾拉曼領(lǐng)域幾十年的難題，難以在現(xiàn)有的技術(shù)框架中得到圓滿解決。

圖1. 數(shù)字膠體增強拉曼光譜技術(shù)概念圖。

dCERS成功實現(xiàn)具有普適意義的1fM水平定量靈敏度

上海交通大學生物醫(yī)學工程學院葉堅教授和邵志峰教授團隊發(fā)明了數(shù)字膠體增強拉曼光譜（dCERS），利用膠體納米顆粒，可以實現(xiàn)較高效率的單分子檢測。雖然單分子信號強度波動巨大，這與過去的研究結(jié)果相吻合，但與常見的單分子SERS技術(shù)不同的是，通過將光譜根據(jù)是否存在目標分子拉曼特征峰進行0/1數(shù)字化，亦即陰性光譜和陽性光譜（數(shù)字信號），隨后對溶液中的陽性光譜進行計數(shù)。通過該單分子計數(shù)的方式可以實現(xiàn)對多種分子（如染料分子、代謝小分子、核酸、蛋白）的定量檢測，定量檢測限可以達到1 fM以下（圖2）。其中，dCERS技術(shù)所采用的膠體顆粒的合成步驟簡單，易于放大生產(chǎn)，在應用中，可以方便地取出每個批次的少量顆粒來針對具體的目標分子預先建立標準曲線，從而可以可靠地用于后續(xù)未知濃度樣本的定量。

圖2. dCERS定量檢測原理與不同種類分子的定量標準曲線。

定量重復性精準可控

在實驗中他們發(fā)現(xiàn)，這些通過閾值確定的單分子事件，其出現(xiàn)次數(shù)的分布完全符合泊松統(tǒng)計，因此通過陽性光譜的數(shù)量，可以直接簡單地確定定量靈敏度與準確性，這與傳統(tǒng)的基于模擬信號的定量方法完全不同。如圖3所示，通過增加檢測總光譜數(shù)，可以累積陽性光譜數(shù)量，從而有效提升定量的準確性，定量檢測誤差服從泊松噪聲。因此在真實應用場景下，可以根據(jù)分子的檢出概率和對于準確性、檢測總時長等的需求，通過累積陽性光譜數(shù)來調(diào)控定量檢測的準確性，由此dCERS定量檢測具備精準可控的可重復性。

他們的發(fā)現(xiàn)還證明，針對不同的目標分子，盡管濃度與單分子計數(shù)的依賴關(guān)系具有不同的系數(shù)（需要分別進行標定），這些關(guān)系都符合吉布斯熱力學的理論。事實上，這是第一次明確建立了單分子統(tǒng)計的物理基礎(chǔ)，并可能適用于拉曼光譜之外的其它單分子計數(shù)技術(shù)。

圖3. dCERS定量檢測誤差服從泊松分布。

在環(huán)境保護、食品安全等領(lǐng)域的實用性

為了確立dCERS在實際測量中的潛力，該團隊選取了百草枯和福美雙作為展示實例（圖4）。百草枯是一種高效、劇毒的除草劑，可以誘導帕金森氏病的發(fā)生，目前已有32個國家嚴格禁止其使用。福美雙是一種含硫劇毒殺真菌劑，被歐盟歸為二類致癌物。因此，超高靈敏度的、準確可靠的定量檢測技術(shù)對于這些分子的檢測非常重要，尤其是致癌物，原則上不存在安全劑量。

選取普通的湖水作為背景并混入微量的百草枯，該團隊成功實現(xiàn)了低于歐盟最大殘留量規(guī)定三個數(shù)量級的檢測靈敏度。對于福美雙，該團隊選取了實驗室培養(yǎng)的豆芽提取液，達到了優(yōu)于質(zhì)譜五個數(shù)量級的檢測靈敏度。他們證明了，通過系列稀釋的方法，檢測中的背景干擾可以得到完美的抑制，從而實現(xiàn)準確的靶分子濃度的測量。而dCERS的超高靈敏度和可靠的統(tǒng)計分布是實現(xiàn)這些定量測量的關(guān)鍵基礎(chǔ)。

圖4. dCERS在微量分子檢測中的應用。

本工作展示了dCERS技術(shù)基于單分子計數(shù)實現(xiàn)了超低濃度目標分子在未知復雜背景中的可重復性定量，無需使用任何目標分子的特定標記。由于不同的目標分子大多具有獨特的SERS光譜，dCERS可以實現(xiàn)多種不同分子的同時定量檢測，因此具有很好的應用前景。另外，本工作使用的膠體納米顆?？梢苑奖愕剡M行大規(guī)模生產(chǎn)和制備，而檢測方法相對簡單，因此，dCERS有望進一步推動高靈敏檢測技術(shù)的變革和進步。

今年剛好是發(fā)現(xiàn)SERS技術(shù)的50周年，可以預見，隨著dCERS技術(shù)的進一步成熟，dCERS在生命科學、臨床醫(yī)學、環(huán)境保護、食品檢測、國防與公共安全以及基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域都會得到廣泛的應用。

圖5. 該成果成員：（從左往右）邵志峰、葉堅、畢心緣、Daniel M. Czajkowsky。

實驗室網(wǎng)站：http://www.yelab.sjtu.edu.cn/

該工作得到了上海交通大學古宏晨教授、徐宏教授和沈峰教授的幫助，得到了國家自然科學基金委、國家重點研發(fā)計劃、上海市科學技術(shù)委員會、上海市婦科腫瘤重點實驗室、上海交通大學、王寬誠教育基金會的資助。

原文鏈接： https://www.nature.com/articles/s41586-024-07218-1