NIR-I(700-1000 nm)和NIR-II(1000-1700 nm)染料因其對(duì)皮膚和組織的強(qiáng)穿透力而在生物成像領(lǐng)域備受青睞。目前商用近紅外染料ICG和IRdye800CW存在著生物偶聯(lián)效果較差的缺陷。此外,ZW800-1作為一種近紅外離子型染料,因其親水性和腎臟代謝清除速率快等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用。然而,由于ZW800-1分子骨架中親核位點(diǎn)的存在導(dǎo)致其在生理環(huán)境下易受到生物分子的“進(jìn)攻”,從而導(dǎo)致熒光信號(hào)丟失,不利于長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)示蹤。下載化學(xué)加APP到你手機(jī),更加方便,更多收獲。
Scheme 1. (a)分子的設(shè)計(jì)概念和(b)化學(xué)結(jié)構(gòu)
(圖片來(lái)源:Angew. Chem. Int. Ed.)
基于此,作者發(fā)展了設(shè)計(jì)合成NIR-I花菁染料的新方法(Scheme 1),即分子的平面骨架由2個(gè)或者4個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行“保護(hù)”,該“雙帶隔離”型的共軛NIR-I和NIR-II染料表現(xiàn)出性能的提升。作者利用該策略合成了dsZW800-1分子,由此解決了ZW800-1的熒光信號(hào)減弱問(wèn)題。此外,所合成的分子dsZW1015的吸收和發(fā)射峰位置更是達(dá)到了NIR-II發(fā)射區(qū)域,再次證明了該設(shè)計(jì)策略的通用性。最后,dsZW1015與抗體進(jìn)行偶聯(lián)后的探針還實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤小鼠的體內(nèi)NIR-II成像。
Scheme 2. 中間體4和化合物dsZW800-1的合成路線(xiàn)
(圖片來(lái)源:Angew. Chem. Int. Ed.)
dsZW800-1的合成過(guò)程如Scheme 2所示。關(guān)鍵合成中間體是未束縛染料3,在溫和的條件下通過(guò)將前體1中的4'-氯原子用含有兩個(gè)末端端點(diǎn)為偶氮基團(tuán)的酚2進(jìn)行置換而組裝而成。隨后的皂化反應(yīng)將3轉(zhuǎn)化為未束縛染料4,然后通過(guò)銅催化的偶氮基-炔烴環(huán)加成反應(yīng),將兩個(gè)側(cè)鏈帶連接起來(lái),產(chǎn)率達(dá)62%。
Figure 1. (a)dsZW800-1晶體結(jié)構(gòu)的側(cè)視和端視圖;(b)dsZW800-1晶體結(jié)構(gòu)中的層間距
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單晶結(jié)構(gòu)側(cè)面證實(shí)了分子內(nèi)屏蔽效應(yīng)的存在(Figure 1)。一般情況下,七甲川花菁染料中的滑移面分子間距在3.5-5 ?,而dsZW800-1中熒光分子的間距為9 ?。因此,在聚集態(tài)下,“雙帶”基團(tuán)可以增大分子間距,減小染料的偶極-偶極相互作用。相比于ZW800-1而言,dsZW800-1的最大吸收和發(fā)射峰位置沒(méi)有明顯變化,而在水溶液中的熒光量子產(chǎn)率則有所提升。這也意味著“雙帶隔離”策略能夠有效抑制染料分子與周?chē)h(huán)境作用所產(chǎn)生的非輻射躍遷過(guò)程。
Figure 2. 光照射下化合物的光穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
(圖片來(lái)源:Angew. Chem. Int. Ed.)
此外,作者利用氙燈照射ZW800-1、4和dsZW800-1的PBS緩沖溶液。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知,光學(xué)穩(wěn)定性的強(qiáng)弱順序依次為4 > dsZW800-1和ZW800-1(Figure 2)。4和dsZW800-1穩(wěn)定性的提高得益于位阻屏蔽基團(tuán)能夠有效降低氧氣的光敏化速率,抑制生物分子與單線(xiàn)態(tài)氧的相互作用。
Figure 3. (a)ZW800-1和GSG的反應(yīng)產(chǎn)物;(b)染料穩(wěn)定性比較
(圖片來(lái)源:Angew. Chem. Int. Ed.)
接下來(lái),作者將三種染料與谷胱甘肽(GSH)在PBS緩沖液中進(jìn)行培養(yǎng)。親核基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)后很容易造成花菁染料的吸收峰位置發(fā)生紅移(Figure 3a)。通過(guò)采集不同培養(yǎng)時(shí)間下染料的發(fā)光強(qiáng)度可知,具有“雙帶隔離”保護(hù)的dsZW800-1能夠十分有效地抑制分子中的親核位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng),從而降低在生理環(huán)境下探針熒光信號(hào)丟失的風(fēng)險(xiǎn)(Figure 3b)。
Figure 4. (a)室溫下Pan-dsZW800-1在PBS緩沖液中的吸收光譜;(b)不同時(shí)間段Pan-dsZW800-1染料在荷瘤小鼠體內(nèi)的成像信噪比;(c)小鼠的體內(nèi)熒光圖像;(d)小鼠體內(nèi)不同器官的明場(chǎng)、熒光照片和(e)熒光信號(hào)分布
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作者還對(duì)dsZW800-1的體內(nèi)成像性能進(jìn)行了考察,即將染料與Panitumumab (Pan)抗體相連。偶聯(lián)抗體后的Pan-dsZW800-1的激發(fā)波長(zhǎng)為772 nm,熒光光譜與dsZW800-1一致(Figure 4a),表明染料未發(fā)生聚集。此外,借助商用近紅外體內(nèi)成像裝置可以看出探針在注射72 h后的成像信噪比達(dá)到8,肝臟處的熒光信號(hào)可忽略不計(jì)(Figure 4b-c)。同時(shí),檢測(cè)提取小鼠的各個(gè)臟器的熒光信號(hào)也說(shuō)明Pan-dsZW800-1具有很高的腫瘤特異性(Figure 4d-e)。
Scheme 3.化合物dsZW1015的合成路線(xiàn)
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為了進(jìn)一步提高染料的發(fā)射波長(zhǎng),作者設(shè)計(jì)合成了NIR-II發(fā)射的分子dsZW1015(Scheme 3)。通過(guò)將dsZW1015中的琥珀酰亞胺酯基團(tuán)與Pan相連,得到的PandsZW1015在1000 nm處表現(xiàn)為強(qiáng)吸收峰,并且沒(méi)有明顯的染料聚集現(xiàn)象(Figure 5a)。此外,在注射探針72 h后,腫瘤部位仍能保持很高的熒光信號(hào)值(Figure 5b)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)再次證明了將dsZW1015與特異性抗體偶聯(lián)后,探針可有效地被用于NIR-II成像當(dāng)中(Figure 5c)。
Figure 5. (a)室溫下Pan-dsZW1015在PBS緩沖液中的吸收光譜;(b)不同時(shí)間段Pan-dsZW1015染料在荷瘤小鼠體內(nèi)的成像信噪比;(c)注射/未注射Pan-dsZW1015染料的小鼠明場(chǎng)和熒光圖像
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總結(jié)
美國(guó)圣母大學(xué)Bradley D. Smith教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一系列高性能的七甲川花菁染料。與傳統(tǒng)NIR-I染料ZW800-1相比,dsZW800-1展現(xiàn)出明亮發(fā)射以及更好的化學(xué)穩(wěn)定性。此外,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還表明dsZW800-1更適合作為用于動(dòng)態(tài)追蹤的靶向探針。通過(guò)空間屏蔽和平衡電荷的結(jié)構(gòu)組合,對(duì)dsZW1015中熒光染料的增強(qiáng)疏水性進(jìn)行抵消,從而產(chǎn)生標(biāo)記有染料的抗體,有效地用于活體小鼠的近紅外II區(qū)腫瘤熒光成像。探針的理性分子設(shè)計(jì)法則也為后續(xù)“比率型”和“on-off”近紅外探針的發(fā)展提供了參考。
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