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TOC圖（來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

酶是自然進化形成的高效生物催化劑，一般適用于天然底物和相應(yīng)的生化反應(yīng)。隨著可持續(xù)合成化學(xué)的理念深入推進，有機化學(xué)家們開始探索天然酶的非天然反應(yīng)性，即“催化雜泛性”。近年來，這方面的研究已經(jīng)取得了顯著的進展，尤其是鐵輔因子依賴的P450酶家族，結(jié)合定向進化等生物技術(shù)，其催化活性已經(jīng)從天然的氧化反應(yīng)拓展至不對稱卡賓/氮賓轉(zhuǎn)移等合成反應(yīng)（2018年諾貝爾化學(xué)獎）。相比之下，銅氧化酶作為一大類氧化還原酶家族，在不對稱催化領(lǐng)域的應(yīng)用還十分少見?？紤]到小分子銅配合物在化學(xué)催化方面的多樣性功能，研究銅氧化酶的催化雜泛性以實現(xiàn)非天然不對稱催化反應(yīng)是一個有意義的課題。

近年來，氧化交叉偶聯(lián)反應(yīng)已經(jīng)成為綠色高效的合成工具，可以將兩個富電子親核試劑通過成鍵連接，避免了底物預(yù)功能化，具有顯著的原子經(jīng)濟性。不對稱氧化交叉偶聯(lián)的難點在于同時控制氧化步驟的化學(xué)選擇性和偶聯(lián)步驟的對映選擇性（圖1a）。已知的文獻方法主要是基于化學(xué)氧化或光化學(xué)/電化學(xué)氧化與手性過渡金屬或有機催化劑的組合。氧化還原酶具有催化不對稱氧化偶聯(lián)的潛力，如自然界中銅依賴漆酶催化的γ-萘酮同分異構(gòu)體(M)-ustilaginoidin A的不對稱同源二聚反應(yīng)，具有專一的區(qū)域和對映選擇性（圖1b）。然而，非天然底物的酶促對映選擇性氧化偶聯(lián)反應(yīng)仍然很少。去年，Narayan小組利用工程化P450酶實現(xiàn)了酚類分子生物催化交叉偶聯(lián)反應(yīng)，為軸手性聯(lián)芳基分子的合成提供了有效策略（圖1c）。

圖1. 生物催化氧化交叉偶聯(lián)反應(yīng)（來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

多銅氧化酶（MCOs）廣泛存在與自然界中，一般具有較低的底物特異性，可接納多種天然底物，其中主要類別是酚類化合物。MCOs通過單電子轉(zhuǎn)移機制催化酚的氧化反應(yīng)，生成易二聚或寡聚的活性苯氧自由基，難以控制氧化反應(yīng)下游的反應(yīng)過程。這種性質(zhì)導(dǎo)致漆酶催化的酚類氧化偶聯(lián)反應(yīng)中常形成多種區(qū)域異構(gòu)體和立體異構(gòu)體的混合物，立體化學(xué)的調(diào)控往往依賴于額外的輔助蛋白。

鐘芳銳團隊致力于綠色仿生和生物催化領(lǐng)域的研究，利用化學(xué)原理驅(qū)動酶催化選擇性合成的理念，發(fā)展了含有非天然光敏活性基團的人工光敏金屬酶（J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 617）和“三重態(tài)光酶”（Nature, 2022, 611, 715）?；阢~催化氧化偶聯(lián)反應(yīng)的化學(xué)機制，發(fā)展了多銅氧化酶催化的多酚氧化環(huán)加成反應(yīng)（Green Chem, 2022, 24, 5598.）

在之前的酶催化工作基礎(chǔ)上，構(gòu)思在酚類底物中引入額外的氫鍵供體/受體，可能與酶的手性腔室形成有益的相互作用，從而實現(xiàn)對映體誘導(dǎo)的可能性。由此發(fā)展了對多銅氧化酶CueO催化兩種不同類型吲哚之間的不對稱氧化偶聯(lián)反應(yīng)（圖1d）。這種方法具有良好的底物通用性、優(yōu)異的化學(xué)選擇性/對映選擇性和溫和的反應(yīng)條件。

作者以3-羥基吲哚-2-羧酸1a和吲哚2a作為偶聯(lián)反應(yīng)物進行條件優(yōu)化（表1）。由于后者帶有的缺電子酯基會顯著降低氧化反應(yīng)的活性，這有利于氧化步驟的化學(xué)選擇性，而偶聯(lián)產(chǎn)物3a含有的2,2-二取代吲哚-3-酮骨架也常見于一些生物活性分子。當(dāng)銅酶CueO進行催化反應(yīng)時，模型反應(yīng)在空氣中順利進行，并且在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下（0.1 mol％ CueO，5.0當(dāng)量雙氧水，25℃，24小時）可以得到產(chǎn)物3a，收率為92％，對映選擇性為99％。其他多銅氧化酶，例如Cot A和MnxEFG，也能催化該反應(yīng)，但結(jié)果較差。令人高興的是，CueO細(xì)胞裂解液的結(jié)果與純化酶的結(jié)果幾乎相同，因此大大減少了繁瑣的蛋白質(zhì)純化過程，盡管銅氧化酶在天然生物系統(tǒng)中通常使用分子氧作為最終電子受體，當(dāng)前體系中過氧化氫的效果優(yōu)于分子氧和尿素過氧化氫，這可能是由于雙氧水與Cu2+離子的配位作用帶來了更合適的蛋白質(zhì)構(gòu)象。有機共溶劑的使用解決了底物的溶解度，但需要保持弱堿性以避免酸促進背景偶聯(lián)反應(yīng)。例如，當(dāng)pH≤7.5時，酸催化背景反應(yīng)就會顯著提高，導(dǎo)致ee值降低。

表1. 反應(yīng)條件優(yōu)化 （來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

該CueO催化不對稱交叉偶聯(lián)具有較好的底物兼容性（圖2）。苯環(huán)上具有不同電子和立體性質(zhì)的取代基的吲哚酚、各種含鹵素、CF3或CN的吲哚親核試劑、富電子類吡咯、1,3,5-三甲氧基苯和1,3-二甲氧基苯也同樣適用。除此之外，親核試劑的類型還可以進一步擴展到sp3雜化碳親核試劑，如環(huán)狀和非環(huán)狀β-酮酸酯，相應(yīng)的產(chǎn)物均具有極好的立體選擇性。部分底物的放大實驗（0.3-1.0 mmol）表明產(chǎn)物的產(chǎn)率和光學(xué)純度可以基本保持不變（產(chǎn)物3a、3d、3f和4c）。

圖2. 代表性底物的結(jié)果（圖片來源：基于原圖重新編輯）

多銅氧化酶催化氧化酚類底物一般通過自由基機理進行。為了對該反應(yīng)的機理進行更深入的研究，作者在模型反應(yīng)中添加了自由基清除劑如叔丁基羥基甲苯（BHT）。結(jié)果顯示，產(chǎn)品3a的生成幾乎被完全抑制，高分辨質(zhì)譜（HRMS）檢測到化合物4的生成（圖3a）。這一結(jié)果表明，反應(yīng)可能經(jīng)歷了酚氧自由基中間體的形成。另一方面，當(dāng)不加2a時，高分辨質(zhì)譜檢測到亞胺中間體5的生成。不過，該中間體非常不穩(wěn)定性，無法分離。相比之下，吲哚2a單獨無法被CueO氧化（圖 3b）。通過兩個底物的氧化還原電勢可以推測，CueO首先催化氧化吲哚酚1a形成中間體5，隨后與吲哚2a發(fā)生親核加成。由于相關(guān)文獻表明，加成步驟需要酸活化，作者推測CueO應(yīng)該起到了催化氧化和酸催化的雙重角色。CueO的蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB：3OD3）包含四個銅原子：一個類型1銅（T1 Cu）負(fù)責(zé)底物氧化，一個三核簇負(fù)責(zé)氧還原。T1 Cu與兩個組氨酸、一個半胱氨酸和一個軸向配體甲硫氨酸形成三角配位模式，這不利于它提供額外的路易斯酸配位。而從底物譜的結(jié)果中可推測，平面型中間體5具有高度的對映面選擇性。由此，作者通過對CueO晶體結(jié)構(gòu)的活性位點進行仔細(xì)分析，將中間體5作為底物進行對接。模擬表明，中間體5緊密結(jié)合到結(jié)構(gòu)域2界面。利用LigPlot + v.2.2.7可視化分析表明（圖3c），中間體5位于一個由Ala153、Asp187、Lys188、Lys189、Asn240等殘基圍成的口袋。其中最顯著的弱相互作用來自于5的酯基與Asn240的酰胺N-H和Lys188的質(zhì)子化氨基間（圖3d），這些相互作用可能對交叉偶聯(lián)反應(yīng)的立體化學(xué)控制至關(guān)重要。為了驗證這一點，這兩個殘基被突變成丙氨酸，兩個突變體CueO_K188A和Cueo_N240A的選擇性顯著變差（分別為86% ee和55% ee），產(chǎn)率也有所降低，這佐證了上述假設(shè)（圖3d）。

圖3 酶促反應(yīng)機理研究 （來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

文獻表明，2,2-二取代吲哚啉-3-酮類分子可能具有顯著的生物活性。作者利用MTT法測定了部分產(chǎn)物對MCF-7腫瘤細(xì)胞系的毒性，得到了兩個顯著毒性的化合物3f和4a（濃度為50μM）（Figure 4A）。隨后的細(xì)化實驗得到了IC50值分別為34.31 μM和37.2 μM，均高于臨床藥物伊立替康和5-氟尿嘧啶（Figure 4B）。

圖4 生物活性測試 （來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

總結(jié)

總之，鐘芳銳教授團隊以銅酶CueO為生物催化劑，以H2O2為終端氧化劑建立了一種不同吲哚分子間的對映選擇性氧化交叉偶聯(lián)反應(yīng)，具有操作簡便、高原子經(jīng)濟性、較好的底物普適性等特點，提供了一種光學(xué)純2,2-二取代吲哚酮的綠色合成方法，并篩選得到了兩個顯著抗癌活性分子。該工作拓展了多銅氧化酶的催化雜泛性，將啟發(fā)銅酶催化其它非天然氧化反應(yīng)的發(fā)展。

Huan Guo, Ningning Sun, Juan Guo, Tai-Ping Zhou, Langyu Tang, Wentao Zhang, Yaming Deng, Rong-Zhen Liao, Yuzhou Wu, Guojiao Wu, Fangrui Zhong*. Angew. Chem. Int. Ed. 2023,doi:10.1002/anie.202219034