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2月9日，北京大學未來技術學院、北大-清華生命科學聯(lián)合中心陳知行研究員課題組與清華大學生命科學學院、北京市結構生物學高精尖創(chuàng)新中心和北京生物結構前沿研究中心陳春來課題組在 J. Am. Chem. Soc. 雜志上聯(lián)合發(fā)表題為“General strategy to improve the photon budget of thiol-conjugated cyanine dyes”的文章。該研究報道了一種可替代傳統(tǒng)馬來酰亞胺標記化學的全新靶向巰基的位點特異性標記策略，通過S-芳基化類型的生物偶聯(lián)化學可顯著提高花青類熒光團光穩(wěn)定性，助力單分子和細胞內(nèi)熒光顯微成像技術。

近20年來，基于熒光顯微鏡和熒光染料技術的迅速發(fā)展，科學家們能夠以前所未有的時空分辨率來觀測生物分子的位置、動態(tài)與功能。大多數(shù)熒光成像技術，如單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移（smFRET）、單分子追蹤、單分子定位顯微鏡（SMLM）、受激輻射損耗（STED）顯微鏡和MINFLUX顯微鏡，對于染料的一個核心訴求，便是讓每個熒光團分子在光漂白前發(fā)射出更多的光子，即提高熒光染料的光穩(wěn)定性，以實現(xiàn)長時程、高時空分辨率的成像。

在熒光顯微成像時，往往需要將染料精確特異地標記在目標生物分子，甚至特定的標記位點上。迄今為止，與氨基反應的琥珀酰亞胺（NHS）酯和與巰基反應的馬來酰亞胺（MAL）是兩個最常用且廣泛商業(yè)化的標記模塊，用于將有機熒光團共價連接到目標生物分子上。通常，NHS-氨基的化學被用于位點特異性地標記核酸和非特異性地標記蛋白質(zhì)，這是因為含有氨基的賴氨酸殘基在蛋白質(zhì)中豐度較高。而含有巰基的半胱氨酸在蛋白質(zhì)中的豐度較低，因而可以通過蛋白定點突變移除內(nèi)源性的半胱氨酸并在標記位點引入半胱氨酸，利用MAL-巰基標記化學實現(xiàn)蛋白質(zhì)上的位點特異性標記，這一標記方法在單分子熒光和單分子FRET技術中的應用尤為廣泛和重要。

圖1 單分子熒光技術測試示意圖與MAL造成的染料光穩(wěn)定性下降

單分子熒光領域的研究者們發(fā)現(xiàn)，通過MAL-巰基標記在蛋白上的熒光團的光漂白速度要比相同的標記在DNA上的熒光團顯著加快。長期以來，人們將這一現(xiàn)象歸于蛋白質(zhì)上復雜的微環(huán)境加速了熒光團的光漂白。8年前（2015年），陳春來課題組在實驗中意外發(fā)現(xiàn)，即便是標記在相同序列DNA鏈上的相同熒光團分子，僅是NHS-氨基和MAL-巰基標記化學的差異，就會顯著影響熒光團的光學特性和光漂白（圖1）。進一步的測試發(fā)現(xiàn)，這一現(xiàn)象廣泛存在于各類染料之中，無論母體是羅丹明類（Rhodamine）還是花青（Cyanine）類染料，都會因MAL標記方式而造成約2—5倍不等的光穩(wěn)定性下降（圖1）。基于結果猜測，MAL標記形成的高活性的硫醚基團加速了染料的光漂白。

圖2 不同標記策略化學反應示意圖

在發(fā)現(xiàn)了新現(xiàn)象和揭示了新機制后，下一步自然是提高巰基標記化學的光穩(wěn)定性。2018年，陳知行加入北京大學，建立了分子探針技術實驗室，兩個不同背景的課題組在此碰撞出了火花。他們嘗試利用空間位阻效應，調(diào)節(jié)連接基團的長度和結構，阻礙硫醚基團與熒光團的碰撞，從而減弱光漂白，提高光穩(wěn)定性。然而這一策略并不順利。2020年夏天，陳知行課題組提出通過改變硫醚的電子性質(zhì)的策略來影響光漂白，并將目光投向了生物偶聯(lián)化學。目前廣泛應用的NHS和MAL化學已經(jīng)是20世紀五六十年代的成果了，近年來雖然也有一系列可以替代MAL的生物偶聯(lián)模塊發(fā)表，但是由于MAL化學的反應速度和反應效率已經(jīng)足夠滿足一般實驗的需求，新一代的生物偶聯(lián)化學完全沒有落到實際應用層面。但幸運的是，近10年來發(fā)展了一系列基于S_NAr反應的生物偶聯(lián)模塊，它們與巰基反應后的產(chǎn)物都是與缺電子的芳基共軛的硫醚（圖2）。于是，苯基氧化二唑（POD）、對氯硝基苯（PCB）和五氟苯探針（FBP）為偶聯(lián)模塊的花青染料被合成出來并進行了測試。測試結果中表現(xiàn)最好的POD模塊相比MAL模塊而言，對于兩種花青染料Cy3和Cy5在DNA上分別有2.3倍與2.5倍的改善，在不同蛋白質(zhì)的不同標記位點上也分別有1.4—2.6倍和1.3—3.1倍的改善。后續(xù)，這一策略被擴展到Cy3B和Cy5B兩種光學性質(zhì)更優(yōu)的染料上，并對這些染料對進行了單分子FRET持續(xù)時間的測試和比較。結果為應用POD的模塊對可以相對MAL模塊大幅改善染料光穩(wěn)定性（圖3），為單分子熒光技術提供了更好的工具。

圖3 POD策略延長了smFRET技術的測量時長

綜上，這項研究發(fā)現(xiàn)了影響染料光穩(wěn)定性的新的關鍵因素，并且在此基礎上提出了全新的策略用于改善基于巰基的共價標記熒光團的光穩(wěn)定性。值得指出的一點是，該策略為生物偶聯(lián)反應的開發(fā)領域提供了一種全新的視角。從前對生物偶聯(lián)策略的評價往往都是對于底物反應性、反應效率和產(chǎn)物穩(wěn)定性等關于反應本身的種種考量；從此研究中可以看到，反應生成的產(chǎn)物基團可能會直接影響后續(xù)的應用結果，為科學工作者應用生物偶聯(lián)反應提供了新的考量角度。該研究對于染料的改進方式簡潔，可以由商業(yè)可得的花青類染料直接改造得到，無需從頭設計與合成染料分子，具有較好的應用前景。

北京大學未來技術學院2019級博士生張源、清華大學生命科學學院博士后楊辰為本文的共同第一作者。陳春來、陳知行為本文的共同通訊作者。清華大學已畢業(yè)博士生彭思佳和張璐嘉進行了重要的探索工作。國家自然科學基金委、科技部國家重點研發(fā)計劃、北京市生命科學前沿培育項目、北京市結構生物學高精尖創(chuàng)新中心和北京生物結構前沿研究中心提供了經(jīng)費資助。清華大學蛋白質(zhì)研究技術中心細胞影像平臺提供了技術支持。

陳春來課題組長期關注單分子熒光技術的開發(fā)并揭示生物分子的動態(tài)和機制。陳知行課題組一直致力于通過化學原理設計并研發(fā)新型探針，助力未來成像技術的發(fā)展。兩個團隊均常年招收博士研究生和博士后，歡迎關心未來熒光技術發(fā)展的同學和同事加入。