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圖1. 酶催化環(huán)胺的高對(duì)映選擇性α-C–H功能化（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

飽和含氮雜環(huán)（如吡咯烷、哌啶、嗎啉）是許多藥物和生物活性天然產(chǎn)物的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)組成，通過C(sp³)–H功能化策略合成這類分子一直是科研工作者們努力的方向。但是大多數(shù)的C(sp³)–H功能化策略需要多步合成步驟才能實(shí)現(xiàn)，例如首先通過強(qiáng)堿作用生成活性a-胺基陰離子，然后使用過渡金屬催化實(shí)現(xiàn)烷基化/芳基化（圖2a）；使用氧化C–H功能化方法先生成亞胺陽離子中間體，然后再和碳親核試劑反應(yīng)（圖2b）；經(jīng)過光氧化還原反應(yīng)生成胺基自由基后通過過渡金屬催化實(shí)現(xiàn)烷基化/芳基化（圖2c）。酶具有的專一化學(xué)選擇性、可持續(xù)性，以及可以通過蛋白質(zhì)工程優(yōu)化活性和立體選擇性，使酶催化成為實(shí)現(xiàn)C–H功能化強(qiáng)有力的手段。目前使用小分子有機(jī)金屬催化劑通過金屬-卡賓插入手段實(shí)現(xiàn)C–H功能化已多有報(bào)道，然而，對(duì)映選擇性分子間的C(sp³)?H卡賓插入仍具有很大的挑戰(zhàn)性，僅有的可行策略很大程度上局限于銠催化體系和“給體-受體”卡賓轉(zhuǎn)移試劑。近年來，Rudi Fasan 團(tuán)隊(duì)和Hartwig團(tuán)隊(duì)（Science 2016, 354, 102）以重氮乙酸乙酯（EDA）為卡賓前體，利用含有金屬取代血蛋白的人工金屬酶分別實(shí)現(xiàn)了鄰苯二甲醚類底物的C(sp³)?H烷基化以及吲哚類底物的C?H功能化（圖2d）。最近，Arnold等人則報(bào)道了一種來自P450_BM3（P411-CHF）的生物催化劑（Nature 2019, 565, 67），用于將EDA對(duì)映選擇性插入芐基和烯丙基C(sp³)?H鍵中（圖2e），該生物催化劑經(jīng)過優(yōu)化可以實(shí)現(xiàn)a-C?H烷基化反應(yīng)。盡管取得了這些進(jìn)展，但通過卡賓轉(zhuǎn)移的酶催化C(sp³)?H功能化使用范圍仍具有很大的局限性。在此，作者使用重氮酮和重氮酯作為卡賓給體，報(bào)道了一種多功能的生物催化體系，以高效和高對(duì)映選擇性實(shí)現(xiàn)了對(duì)環(huán)胺的單/雙a-C(sp³)?H官能團(tuán)轉(zhuǎn)化（圖2）。

圖2. a-C?H功能化的化學(xué)催化法和生物催化法（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

首先，作者嘗試了一系列肌紅蛋白及其類似物來催化未被報(bào)道過的N-取代吡咯烷2a與重氮酮1a的分子間C–H功能化（表1），然而，這些肌紅蛋白類似物無論是在整個(gè)細(xì)胞中還是作為純化的蛋白質(zhì)均沒有表現(xiàn)出反應(yīng)活性（entries 1-3）。作者同樣嘗試了文獻(xiàn)中可將EDA對(duì)映選擇性插入芐基和烯丙基C(sp³)?H鍵中P450系列生物催化劑（比如P450 XplA, P450_cam, CYP119），但同樣沒有得到可檢測(cè)到的反應(yīng)活性（entries 4-5）。鑒于嘗試的野生型P450生物酶缺乏反應(yīng)活性，作者通過將位于靠近血紅素輔助因子的氨基酸殘基替換為丙氨酸，以此來系統(tǒng)性地改變這些酶的活性位點(diǎn)以及提高對(duì)目標(biāo)底物的識(shí)別性能，得到了0.4%的收率（entry 6）?；诖?，作者將CYP119（T213A）中的Cys317殘基突變?yōu)槠渌牡鞍踪|(zhì)親核氨基酸殘基，如組氨酸（His）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）、天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu），當(dāng)使用CYP119（T213A, C317S）為催化劑時(shí)，得到了2%的收率和69:31的對(duì)映選擇性（entry 7）。作者還發(fā)現(xiàn)這類由絲氨酸連接的CYP119變體酶與CO結(jié)合的鐵質(zhì)形式在406 nm處顯示一個(gè)Soret峰（圖3b）。為了進(jìn)一步提高對(duì)胺2a的C?H功能化反應(yīng)性，作者對(duì)CYP119（T213A，C317S）進(jìn)行了多次活性位點(diǎn)誘變和篩選，例如將圖3a中活性位點(diǎn)殘基L69、F153、L205、A209和V254分別隨機(jī)使用或組合使用各種氨基酸殘基（Gly, Ala, Ser, Val, Leu, Trp, Thr, Asn, Gln, Cys, Pro, Ile, Met, Phe, Thr），將這些生物酶在大腸桿菌（E. coli）C41 (DE3)中表達(dá)并在96孔板中作為全細(xì)胞進(jìn)行篩選，最終篩選得到高達(dá)er = 99.5:0.5的目標(biāo)產(chǎn)物3a（圖3c，表1，entries 8-12）。最終，作者發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞密度（OD₆₀₀）為40的全細(xì)胞上進(jìn)行反應(yīng)，以CYP119（F153G, A209G, T213A, V254A, C317S）（即CHI-DA）作為酶催化劑，可以得到高達(dá)99%的收率、er = 99.5: 0.5的對(duì)映選擇性以及TON = 12900 的高催化活性（entry 10），該TON值比之前使用P411對(duì)其它C?H卡賓插入反應(yīng)的催化活性高一到兩個(gè)數(shù)量級(jí)（圖2e）。

表1. 酶催化劑的篩選（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

圖3. CYP119催化劑的結(jié)構(gòu)、光譜特性和催化效果（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

該反應(yīng)具有良好的底物范圍（圖4）。作者嘗試了不同取代基的N-芳基吡咯烷衍生物（2b-l），對(duì)于對(duì)位取代的底物，例如2b（p-Me）、2e（p-F）和2f（p-Cl），均可以良好的收率（51-93%）和對(duì)映選擇性（86:14-91:9 e.r.）得到相應(yīng)的產(chǎn)物（圖4）。但是當(dāng)在鄰位和間位有取代基時(shí)，該反應(yīng)收率及對(duì)映選擇性均較低（圖4, 3c, 3h, 3i, 3j），為了解決該底物范圍的限制，作者嘗試了其它較高活性的CHI-g(1-3)系列酶，進(jìn)而使得鄰位、對(duì)位底物（例如2c, 2h, 2i, 2j）以及吡啶類底物（2j）能夠以較高的收率和對(duì)映選擇性得到目標(biāo)產(chǎn)物（圖5）。

圖4. 底物范圍（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

圖5. 基于CYP119的酶催化劑活性及選擇性（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

此外，作者嘗試了用EDA做底物對(duì)N-苯基吡咯烷進(jìn)行C–H功能化（表2）。相似地，作者首先在全細(xì)胞中篩選了基于CYP119活性位點(diǎn)的丙氨酸殘基酶，此時(shí)的野生型CYP119和大多數(shù)丙氨酸突變體在該反應(yīng)中表現(xiàn)出了可檢測(cè)的活性（entries 1-3）；隨后作者將最有利的丙氨酸突變（T213A）與軸向配體突變C317S相結(jié)合，有效提高了反應(yīng)收率、對(duì)映選擇性和TON值（entry 4）；當(dāng)作者使用三重突變體CYP119（T213A，V254A，C317S）（即CHI-g1）時(shí)，得到了高達(dá)99%的收率和er = 79:21的對(duì)映選擇性（entry 5）。為了提高該反應(yīng)的對(duì)映選擇性，作者對(duì)該催化劑作了進(jìn)一步地改進(jìn)，最終在使用四突變體CYP119（F153G, T213A, V254A, C317S）（即CHI-EDA）作為催化劑時(shí)得到了89%的收率，er = 87:13的對(duì)映選擇性和TON = 8920的催化活性（entry 6）。以純化的酶催化該反應(yīng)得到了類似的收率和對(duì)映選擇性，但是TON大幅降低（entry 7）；若使用四突變體CYP119（A209W, T213G, V254A, C317S）催化該反應(yīng)，則會(huì)得到相反的對(duì)映選擇性（entry 10）。

表2. 以EDA為底物的反應(yīng)條件篩選（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

作者還探索了重氮丙酮和EDA的立體發(fā)散雙C–H功能化。作者在前期篩選工作中，發(fā)現(xiàn)某些高活性的變體酶可以使得反應(yīng)進(jìn)行雙C–H功能化，進(jìn)而得到順式和反式的2,5-二取代產(chǎn)物（圖6a）；作者還發(fā)現(xiàn)不同的CYP119變體酶催化得到的順式和反式異構(gòu)體產(chǎn)物比例存在明顯差異，這表明雙插入反應(yīng)的立體選擇性可以通過蛋白質(zhì)工程來調(diào)節(jié)。最終，作者通過篩選一系列CYP119酶，成功用一鍋法將兩種不同的重氮試劑進(jìn)行串聯(lián)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)立體發(fā)散雙C?H功能化，高選擇性地產(chǎn)生三種立體異構(gòu)產(chǎn)物（圖6b-c），即順式cis-(S,R), 反式trans-(S,S)和trans-(R,R)。

圖6. 立體發(fā)散的雙C–H功能化（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

最后，作者還嘗試了將此C–H功能化應(yīng)用于高級(jí)藥物（例如抗糖尿病藥物sitagliptin）的后期衍生化中（圖7），該分子除了金屬配位基團(tuán)（三唑）存在外，還具有一個(gè)稠合的哌嗪環(huán)，多個(gè)反應(yīng)活性相似的a-C?H鍵使得該反應(yīng)的區(qū)域選擇性面臨巨大的挑戰(zhàn)。作者首先嘗試了在EDA的存在下，對(duì)MOM保護(hù)的化合物11a進(jìn)行催化劑篩選，發(fā)現(xiàn)使用CYP（T213A，C317S）可以成功進(jìn)行C(sp³)?H功能化，經(jīng)過脫保護(hù)后可以得到33%的總收率和er = 79:21的對(duì)映選擇性。值得注意的是，同樣的酶能夠以相近的對(duì)映選擇性（er = 74:26）使未保護(hù)的中間體11b產(chǎn)生雙N?H/C?H插入產(chǎn)物13以及N?H插入產(chǎn)物14（圖7），證明了生物酶催化的C–H功能化在藥物后期衍生化中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

圖7. Sitagliptin母核的后期衍生化（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）