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熒光成像技術(shù)具有高時(shí)空分辨率、無(wú)損顯現(xiàn)和靈敏度高等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像等領(lǐng)域。與可見(jiàn)光區(qū)（400-700 nm）相比，近紅外第二窗口（NIR-II，1000-1700 nm）具有更弱的組織吸收和自發(fā)熒光，因此更有利于提高成像的穿透深度。此外，相比于納米材料探針來(lái)講，NIR-II熒光小分子具有結(jié)構(gòu)易裁剪、發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)、光物理性質(zhì)可控、低毒性和代謝速度快等優(yōu)勢(shì)。其中，NIR-II熒光小分子吲哚菁綠（ICG）在1956年就被美國(guó)食品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床診斷和手術(shù)造影當(dāng)中。除了ICG，包括聚次甲基類(lèi)，苯并噻二唑類(lèi)和二吡咯甲基二氟化硼類(lèi)也都被報(bào)道用于NIR-II 成像當(dāng)中(Scheme 1a)。盡管NIR-II熒光小分子的發(fā)展已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步，但是仍面臨著B(niǎo)BB穿透性差的不足。

Scheme 1. NIR-II熒光小分子骨架（圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc.）

本文中，作者通過(guò)調(diào)控（BF₂）formazanate染料中的苯胺取代基，得到了一系列具有相對(duì)分子質(zhì)量小、油水分配系數(shù)適宜（logP = 1~3）和低極性表面的NIR-II熒光小分子（Scheme 1b）。在（BF₂）formazanate骨架上修飾不同的給電子基團(tuán)，染料在胎牛血清（FBS）和DMSO溶液中表現(xiàn)出了NIR-II發(fā)射。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明所合成的染料具有超高的光學(xué)穩(wěn)定性、大斯托克斯位移和明亮發(fā)射。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)也證明了該系列染料可以有效地穿透BBB從而進(jìn)行無(wú)損的NIR-II腦成像。此外，染料還能夠區(qū)分正常腦組織和GBM組織，從而進(jìn)行特異性地成像檢測(cè)。

Figure 1. BF1-BF8染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及在不同有機(jī)溶劑和生物基質(zhì)中的光物理表征。（圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc.）

（BF₂）formazanate熒光團(tuán)由于高度離域的π-體系和低階前線軌道而具有豐富的光物理性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中，作者合成了一系列NIR-II小分子（Figure 1a）。理論計(jì)算也表明HOMO和LUMO的電子云主要分布在BF₂骨架上，其余分布在N的1,3-號(hào)位上的π-共軛芳香環(huán)（Figure 1b）。接下來(lái)，作者測(cè)試了（BF₂）formazanate染料在有機(jī)溶劑和生物基質(zhì)中的光物理性質(zhì)。BF1-BF8在DMSO中的NIR吸收峰在727-859 nm范圍內(nèi)。隨著取代基的不同，染料在DMSO中的吸收峰也逐漸紅移（Figure 1c），DMSO和FBS溶液中染料的發(fā)射波長(zhǎng)范圍在800-1400  nm（Figure 1d）。如Figure 1e所示，采用不同的長(zhǎng)通濾光片對(duì)染料發(fā)光進(jìn)行過(guò)濾后，BF1-BF8仍能保持熒光波長(zhǎng) >1000 nm的明亮發(fā)射。值得一提的是，BF1染料在DMSO和FBS溶液中分別表現(xiàn)出230 nm和198 nm的Stokes位移（Figure 1f）。此外，BF1在FBS溶液中還能保持較高亮度的NIR-II發(fā)射（Figure 1g）。在光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，BF1在長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度的激光照射下仍能保持良好的發(fā)射行為，性能要優(yōu)于ICG染料（Figure 1h）。此外，BF1在高pH和活性氧成分的存在條件下，仍可以展現(xiàn)出良好的化學(xué)穩(wěn)定性（Figure 1i）。

Figure 2. BF1-BF8染色U-87 MG細(xì)胞的熒光成像及體外穿透血腦屏障模型測(cè)試。（圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc.）

接下來(lái)，作者將U-87MG細(xì)胞分別與BF1-BF8染料進(jìn)行共培養(yǎng)。細(xì)胞圖像表明所有的染料都具有良好的細(xì)胞膜穿透性和明亮的NIR-II發(fā)光（Figure 2a）。作者還進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)染料光穩(wěn)定性的測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相比于ICG，BF1具有更好的光學(xué)穩(wěn)定性（Figure 2b,c）。為了測(cè)試（BF₂）formazanate染料的BBB滲透性，作者還制備了體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停‵igure 2d），數(shù)據(jù)表明BF1和BF6具有較高的BBB滲透率（Figure 2e）。BF1和BF6的體外模擬組織穿透性測(cè)試也證明在5 mm的深度下也依然能夠觀察到兩種染料的熒光信號(hào)（Figure 2f-i）。

Figure 3. BF1-BF8染料對(duì)小鼠腦血管和組織的NIR-II成像。（圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc.）

鑒于（BF₂）formazanate染料的優(yōu)越的光學(xué)性質(zhì)，作者考察了BF1和BF6的活體成像性能。如Figure 3a,c所示，采用尾靜脈注射小鼠活體后，在腦組織中依然能夠看到BF1和BF6的發(fā)光信號(hào)，成像信噪比高達(dá)2.5-2.9（Figure 3b,d）。對(duì)比之下，注射ICG之后，僅能在主要的腦血管中觀察到其熒光信號(hào)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，信號(hào)則逐漸消失（Figure 3e,f）。此外，在活體注射2 h后，BF1和BF6主要在腦組織中積累，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)（Figure 3g,h）。為了進(jìn)一步證實(shí)BF1和BF6的BBB穿透性，作者還分別對(duì)所提取腦組織中的染料分子進(jìn)行了質(zhì)譜和高效液相色譜的表征（Figure 3i-k）,再次證明了BF1和BF6具有高BBB通透性。作者選用具有較高成像信噪比的BF6作為研究對(duì)象并對(duì)其穿透BBB的過(guò)程進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。相比于ICG來(lái)講，BF6的動(dòng)態(tài)擴(kuò)散速率更快，更易于穿透BBB（Figure 3l-p）。

Figure 4.患有原發(fā)性膠質(zhì)瘤的小鼠模型在尾靜脈注射BF1/BF6和ICG后不同時(shí)間段的白光和NIR-II圖像測(cè)試。（圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc.）

最后，作者分別將BF1、BF6和ICG注射到患有GBM的模型小鼠體內(nèi)，可以看到BF1和BF6在腦組織中表現(xiàn)出明顯的熒光信號(hào)（Figure 4a-d）,證明了兩種染料可以達(dá)到優(yōu)異的活體成像效果。