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在可見光區(qū)進(jìn)行光轉(zhuǎn)化的熒光染料在生物成像領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用。雖然高效的光轉(zhuǎn)換熒光蛋白已經(jīng)得到應(yīng)用，但是如何發(fā)展小尺寸、高性能和實(shí)用性強(qiáng)的光轉(zhuǎn)換熒光探針仍是值得關(guān)注的問(wèn)題。利用雙色光轉(zhuǎn)化熒光團(tuán)（DCPFs）在轉(zhuǎn)化前后發(fā)光顏色及強(qiáng)度的變化，研究者可以用來(lái)追蹤標(biāo)記物的動(dòng)態(tài)變化。目前，DCPFs的設(shè)計(jì)原則包括羅丹明染料的脫烷基化、花菁類染料的光截?cái)?、AIE分子的光脫氫環(huán)化、噁嗪的螺吡化和光氧化脫氫等。盡管DCPFs的發(fā)展已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但是仍存在著光轉(zhuǎn)換效率低、發(fā)光強(qiáng)度弱以及需要光毒性的紫外光激發(fā)等缺陷。

本文中，作者建立了構(gòu)筑DCPFs的新策略，即基于定向光氧化誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換（DPIC）機(jī)理。作者認(rèn)為熒光團(tuán)在經(jīng)歷部分定向光漂白后，激發(fā)和發(fā)射光譜會(huì)發(fā)射移動(dòng)。

熒光團(tuán)在光照后產(chǎn)生單線態(tài)氧發(fā)生光漂白，導(dǎo)致不可逆的光化學(xué)裂解生成不發(fā)光產(chǎn)物。作者設(shè)想在熒光團(tuán)上修飾芳香性單線態(tài)氧活性基團(tuán)（ASORM）后可以1）增加體系的共軛導(dǎo)致光譜紅移；2）單線態(tài)氧定向氧化ASORM后，導(dǎo)致共軛結(jié)構(gòu)被破壞，從而引起激發(fā)和發(fā)射光譜的移動(dòng)（Figure 1）。

Figure 1. 定向光氧化誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化（DPIC）原理及光照后分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

研究中，作者選擇香豆素作為小尺寸、高亮度藍(lán)光發(fā)射的熒光團(tuán)。香豆素染料具有高摩爾消光系數(shù)、明亮發(fā)射和低細(xì)胞毒性的特點(diǎn)，非常適合作為熒光成像探針。小尺寸的吡咯和呋喃基團(tuán)能夠在單線態(tài)氧作用下發(fā)生光氧化導(dǎo)致脫芳構(gòu)化，因此被選作為ASORM。香豆素骨架與N-甲基吡咯和呋喃通過(guò)Witing反應(yīng)偶聯(lián)分別得到共軛程度提高的苯乙烯基-香豆素類衍生物SC-P和SC-F（Figure 1）。為了證明在光轉(zhuǎn)換過(guò)程中ASORM的獨(dú)特作用，作者還合成了苯乙烯基-香豆素噻吩（SC-T）和苯乙烯基-香豆素茴香醚（SC-A）作為對(duì)照。

Figure 2. SCs的光譜研究和光照實(shí)驗(yàn)（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

作者對(duì)合成的苯乙烯基-香豆素類衍生物（SCs）進(jìn)行了光學(xué)性質(zhì)表征。SCs在不同溶劑中都表現(xiàn)為高亮度發(fā)射和大摩爾消光系數(shù)，并伴隨著輕微的溶劑化效應(yīng)。在甲醇溶劑中，SC-T、SC-F和SC-A的吸收和發(fā)射峰位置相近，分別在425和512 nm處（Figure 2A），熒光量子產(chǎn)率能夠達(dá)到0.77，SC-P表現(xiàn)出明顯的光譜紅移現(xiàn)象。為了表征化合物的雙色光轉(zhuǎn)換特性，作者用488 nm激光激發(fā)染料的甲醇溶液并記錄下不同時(shí)間點(diǎn)下的發(fā)射光譜（Figure 2B）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與SC-A和SC-T表現(xiàn)的緩慢光漂白現(xiàn)象相比，含有ASORM的SC-F和SC-P則表現(xiàn)出在光照后明顯的藍(lán)移現(xiàn)象，分別移動(dòng)了24 nm和68 nm，發(fā)射波長(zhǎng)也分別藍(lán)移至486 nm和483 nm（Figure 2C-D）。為了更好地表征光轉(zhuǎn)換產(chǎn)物（cSC），作者對(duì)光照前后的化合物進(jìn)行了液質(zhì)色譜分析（Figure 2E）。數(shù)據(jù)顯示SC-P和SC-F會(huì)轉(zhuǎn)換為氧化形式的異構(gòu)體，由于ASORMs的脫芳構(gòu)化會(huì)使其吸收光譜出現(xiàn)藍(lán)移。同時(shí)，由于光轉(zhuǎn)換產(chǎn)物cSC-P 、cSC-F和SC-V的激發(fā)和發(fā)射光譜的相似性，可以推斷出光轉(zhuǎn)換的機(jī)制來(lái)源于香豆素和ASROM之間共軛程度的破壞（Figure 2F）。

Figure 3. 定向光氧化誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的內(nèi)在機(jī)制（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

如Figure 3所示，SC-P在被可見光照射后達(dá)到激發(fā)態(tài)，再傳能至三線態(tài)氧³O₂，³O₂通過(guò)系間穿越過(guò)程和三線態(tài)弛豫過(guò)程產(chǎn)生單線態(tài)氧¹O₂）。在單線態(tài)氧的存在下，SC-P經(jīng)歷了光轉(zhuǎn)換過(guò)程。以上實(shí)驗(yàn)證明了DPIC機(jī)制導(dǎo)致了熒光探針的雙發(fā)射光轉(zhuǎn)換性質(zhì)。

Figure 4. SC-P標(biāo)記的Hela細(xì)胞的共聚焦成像圖片（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

為了證明基于DPIC機(jī)制的熒光探針的實(shí)用性，作者將具有最快光轉(zhuǎn)換速率和波長(zhǎng)變化最大的化合物SC-P作為研究對(duì)象，并將其對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記（Figure 4）。從Fgiure 4A-B中可以看出，在488 nm激發(fā)光照射下，光轉(zhuǎn)化過(guò)程發(fā)生并伴隨著SC-P強(qiáng)度的減弱和cSC-P強(qiáng)度的增加。同時(shí)，作者將SC-P與商用染料SMCy 5.5進(jìn)行共染，可以看出SC-P的親脂性和電中性使其可以特異性地靶向脂滴，共定位系數(shù)能夠達(dá)到83%（Figure 4C）。此外，光轉(zhuǎn)換后的產(chǎn)物cSC-P也依然能夠保持對(duì)脂滴良好的靶向性（Figure 4D）。最后，作者又證明了SC-P和cSC-P能夠?qū)χ芜M(jìn)行時(shí)空動(dòng)態(tài)示蹤，可以媲美于商用染料SMCy 5.5的成像效果（Figure 4E-F）。