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目標導(dǎo)向合成（TGS）是一種無需事先合成和高通量篩選即可識別目標選擇性先導(dǎo)物的強大工具。它已被有效地用于各種治療性蛋白和核糖核蛋白靶點的抑制劑的簡單合成。然而，作為模板的DNA/RNA靶點在設(shè)計和開發(fā)用于調(diào)節(jié)基因功能的小分子方面的研究仍然較少。

由于肽和擬肽大環(huán)的結(jié)構(gòu)限制，它們表現(xiàn)出代謝穩(wěn)定性和增強的生物分子靶標結(jié)合親和力仿肽大環(huán)的大表面積阻止了與雙鏈DNA的插層結(jié)合，并顯示了對DNA四鏈的選擇性。疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)已被用作構(gòu)建大環(huán)骨架的工具，在肽和碳水化合物化學(xué)、超分子系統(tǒng)和藥物化學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。雙官能團片段之間的雙環(huán)加成進行大環(huán)化需要很高的稀釋條件。通過原位雙擊反應(yīng)合成靶標導(dǎo)向的多肽，如大環(huán)配體，不僅能有效構(gòu)建大環(huán)結(jié)構(gòu)，還有助于識別生物靶標的結(jié)合劑。然而，從反應(yīng)混合物中識別原位生成的配體一直具有挑戰(zhàn)性。在這項工作中，作者團隊提出了G4s可以選擇性地導(dǎo)向雙炔和雙疊氮片段合成一個大環(huán)類肽的方案（Scheme 1）。這種大環(huán)配體也已在活細胞中由其相應(yīng)片段合成，顯示出很有前景的生物學(xué)特性。

Scheme 1. DNA功能化磁性金納米顆粒靶向?qū)蚝铣蒅4選擇性配體的示意圖（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

為了生成目標特異性配體，作者制備了6個雙炔（1a-f）和9個單/雙疊氮（2a-i），其中包含脂肪族、芳香族和羧酰胺官能團以及烷基胺側(cè)鏈（Fig. 1a-b）。以c-MYC、h-TELO、c-KIT1、c-KIT2、BCL2 G4 DNA和一個dsDNA作為DNA模板，在鍍金磁性納米顆粒（AuMNPs）上進行瞬間共價系鏈（Scheme 1）。UV-Vis光譜證實了DNA與納米顆粒的結(jié)合（Fig. 1）。CD光譜顯示，固定在Au-MNPs上的c-MYC, c-KIT1, c-KIT2, BCL2和h-TELO G4s具有典型的CD特征，并保持其G4構(gòu)象。在反應(yīng)性方面，c-MYC G4-AuMNPs生成雙三唑基大環(huán)配體M1，h-TELO G4-AuMNPs也得到了相同的產(chǎn)物（Fig. 1c-d），并且前者具有更高的相對產(chǎn)率。

Fig 1. G4納米模板定向原位環(huán)加成（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

為了確定原位生成M1的區(qū)域選擇性，作者在高稀釋條件下用標準Cu(I)-催化疊氮炔環(huán)加成（CuAAC）合成了M1（Fig. 2a）。觀察到原位反應(yīng)和Cu(I)-催化反應(yīng)都產(chǎn)生1,4-雙取代的抗三唑區(qū)域異構(gòu)體。

為了了解這類大環(huán)的結(jié)合特性，作者團隊進一步通過Cu(I)-催化CuAAC合成了3個結(jié)構(gòu)相似的化合物M2、M3和M4（Fig. 2a-b）。G4定向合成沒有檢測到1b和2b組分形成的大環(huán)M4。含雙疊氮化合物（2a，2b）的吡啶雙羧基酰胺（1a，1b）與含雙炔化合物的吡啶雙羧基酰胺（1a，1b）的反應(yīng)，得到高收率（70-78%）的雙三唑大環(huán)M1-M4（Fig. 2a-b）。這類大環(huán)包含4個酰胺鍵和2個酰胺鍵同構(gòu)體（三唑結(jié)構(gòu)單元），可作為細胞內(nèi)靶點的潛在治療性擬肽配體。

Fig 2. Cu(I)-催化疊氮炔環(huán)加成反應(yīng)合成M1-M4大環(huán)化合物及其結(jié)構(gòu)和分子對接（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

M4的結(jié)構(gòu)通過單晶X-射線分析確認（Fig. 2c），由于這些大環(huán)（M1-M4）的大環(huán)核具有精確的幾何互補和較大的表面積，預(yù)計它們對G4 DNA具有選擇性。此外，用熒光滴定法測定配體對不同G4的結(jié)合親和力（Kd）。觀察結(jié)果表明，盡管兩種配體都與h-TELO結(jié)合，但它們對c-MYC的結(jié)合親和力相對較高（Fig. 3c）。與M1和M2相比，具有相似循環(huán)核的配體M3和M4對c-MYC沒有太大的特異性和親和力。與未生成M4的TGS結(jié)果一致，M4對c-MYC、c-KIT2和h-TELO G4s表現(xiàn)出非特異性和弱結(jié)合。這一趨勢表明，帶有側(cè)鏈的大環(huán)配體M1和M2對G4s的結(jié)合親和力高于沒有側(cè)鏈的M3（疊氮基吡啶環(huán)側(cè)鏈）和M4。熒光和ITC研究表明，這些配體與雙鏈DNA的結(jié)合微不足道。分子模型研究進一步表明，配體M1在c-MYC G4的存在下獲得了平坦但靈活的構(gòu)象（Fig. 2e），盡管從晶體結(jié)構(gòu)上觀察到大環(huán)核是非平面的。CD光譜研究顯示，即使存在15摩爾當量的大環(huán)（M1-M4），c-MYC G4也能保持其構(gòu)象。

Fig 3. 配體的RET-melting、Tm和ITC分析（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

接下來，XTT法檢測的細胞毒性結(jié)果表明，配體M1、M2、M3和M4對HeLa細胞具有相似的細胞毒性，但對正常NKE細胞的毒性均較低（IC50 ? 60 μΜ）。流式細胞術(shù)使用凋亡標記（Annexin V和PI）分析顯示，M1誘導(dǎo)61%的細胞群凋亡，10.8%的細胞群壞死。M2還誘導(dǎo)45%的細胞群凋亡，8.7%的細胞群壞死。

Fig 4. 配體分子的qRT-PCR、Western blot、雙熒光素酶測定和免疫細胞化學(xué)分析（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

通過qRT-PCR和Western Blot研究配體對HeLa細胞中相對于管家基因表達的c-MYC基因表達的體外影響（Fig. 4a-c），結(jié)果表明M1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上比M2更有效地抑制c-MYC的表達，而不改變管家基因的表達。雙熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn)M1和M2分別降低了c-MYC啟動子連接的熒光素酶表達51%和40%（Fig. 4d）。然而，M1和M2都沒有改變c-MYC突變啟動子中的熒光素酶表達（不能形成G4結(jié)構(gòu)），這表明觀察到的c-MYC表達下調(diào)是由四聯(lián)體穩(wěn)定引發(fā)的。

接下來，作者通過疊氮和炔的無銅點擊反應(yīng)來探索其在細胞中的可行性。對Hela細胞提取物進行ESI-MS分析，發(fā)現(xiàn)M/z值與M1對應(yīng)，表明細胞大環(huán)化。用1a和2a處理的細胞也增加了約2倍的BG4焦點，這表明細胞內(nèi)形成的M1隨后穩(wěn)定并捕獲內(nèi)源性G四聚體結(jié)構(gòu)。