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自然界利用環(huán)加成反應生成復雜的天然產(chǎn)物骨架。Dehydrosecodine是一種高活性的生物合成中間體，經(jīng)過環(huán)加成可生成幾種生物堿骨架，這些骨架是藥理學上重要化合物如長春堿和伊寶加因的前體。一種生產(chǎn)生物堿的夾竹桃科的植物已經(jīng)進化出了環(huán)化酶，可以催化一種較高活性的底物—Dehydrosecodine（1）的環(huán)加成反應，形成獨特的生物堿骨架。作者和其他團隊最近發(fā)現(xiàn)并表征了已知催化1環(huán)加成反應的酶：水甘草堿合成酶（TiTabS和CrTS）[催化(-)-水甘草堿（2）（抗癌藥物長春堿和長春新堿的前體）的形成]；長春質(zhì)堿合成酶（CrCS）[催化(+)-長春質(zhì)堿（3）（長春花堿和長春新堿的前體）的形成]；和冠狀堿合成酶（TiCorS）[它催化(-)-冠狀定合酶（4）（抗成癮劑伊波加因的前體）的形成]。TiTabS/CrTS和CrCS將1通過[4+2]環(huán)加成直接生成2和3，而TiCorS最初形成一種迄今尚未經(jīng)過表征的不穩(wěn)定中間體，然后被酶還原為4。原則上，底物1可以通過選擇性環(huán)加成反應生成額外的骨架，但這些環(huán)化酶的廣泛突變并沒有導致酶產(chǎn)物譜的擴展。在這里，作者證明了環(huán)化酶TiCorS除了能生成4外，還能產(chǎn)生另一種pseudo-aspidosperma（Ψ-aspidosperma）型生物堿pseudo-tabersonine（Ψ-tabersonine）（5）（Fig. 1）。作者首先通過表征環(huán)化酶TiCorS產(chǎn)生的不穩(wěn)定中間體來展示這種轉(zhuǎn)化背后的機制基礎。這種中間體可以被還原酶捕獲生成4，也可以同時被還原酶和氧化酶捕獲生成替代骨架5。借助氘標記技術研究了這些酶轉(zhuǎn)化的機制。簡而言之，1的化學反應性是由一個環(huán)化酶和一對能異構烯烴部分的氧化還原酶開發(fā)得到，這反過來促進了新的區(qū)域選擇性環(huán)化反應。

Fig. 1: 夾竹桃科植物產(chǎn)生的dehydrosecodine（1）衍生生物堿（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

Tabernanthe iboga，一種通過酶TiTabS和TiCorS分別產(chǎn)生2和4的植物，也產(chǎn)生Ψ-aspidosperma型生物堿20-epi-ibophyllidine（Fig. 1）。為了確定T. iboga酶可以形成(+)-Ψ-tabersonine 5，作者進行了體外偶合生化分析，其中不穩(wěn)定的底物1由上游中間的莖乙酸馬藤堿（6）經(jīng)酶促反應生成。6首先被黃酮類precondylocarpine acetate synthase（PAS）氧化生成precondylocarpine acetate（7），然后被中鏈醇脫氫酶dihydroprecondylocarpine acetate合酶（DPAS）進行1,4-亞胺還原（Fig. 1）。Dihydroprecondylocarpine acetate（8）經(jīng)過一個乙酰氧基的去除生成底物1，然后被一個環(huán)化酶捕獲（Fig. 1）。

Fig. 2: Ψ-tabersonine（5）的生物合成（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

如圖2a所示，作者觀察到在某些條件下，5（而不是4）在使用TiCorS的分析中形成。因此，TiCorS似乎參與了4和5的生成。作者隨后使用異質(zhì)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)進行體外試驗，以探測導致產(chǎn)物選擇性切換的條件。結果發(fā)現(xiàn)：在pH 7.5時，在TiPAS1?3或CrPAS和TiDPAS1參與下，有利于形成5；在pH 7.5，在TiPAS1?3或CrPAS、TiDPAS1和TiTabS的參與下有利于生成2；而在pH 9.5時，在TiPAS1?3、TiDPAS2和TiCorS參與下有利于生成4（Fig. 2a）。之后，作者通過重建這里報道的生物合成酶，使其在Nicotiana benthamiana中產(chǎn)生2、5和9，進一步證實在體外獲得的結果（Fig. 2b）。

此外，Dehydrosecodine的酸穩(wěn)定異構體，angryline（1a），也可以分離和直接用于環(huán)化分析（Fig. 1）。1a必須在pH值高于8.5的情況下使用，在那里它將開環(huán)產(chǎn)生具有反應性的1。當1a代替6（pH值9.5）用于酶學測定時，作者可以觀察到5、2、4和9的生成。值得注意的是，PAS（TiPAS1?3，CrPAS）和TiDPAS1對5和9的形成都是必需的，這表明Ψ-aspidosperma骨架的形成需要這些酶。然而，在4的生產(chǎn)過程中不需要PAS。

為了研究TiCorS的作用機制，作者通過優(yōu)化初始不穩(wěn)定產(chǎn)物的分離的條件，并使用NaBH₄還原捕獲該化合物16-carbomethoxycleavamine（10，¹H NMR表征得到）。這表明TiCorS的初始環(huán)化產(chǎn)物為16-carbomethoxycleaviminium（11）。結合氘標記結果，當TiCorS產(chǎn)物被NaBD₄還原時，這將導致11的1,2-還原反應的發(fā)生（Fig. 3）。值得注意的是，相關環(huán)化酶CrCS的晶體結構（70.8%基因序列一致性）顯示，CS最初形成(+)-16-carbomethoxycleaviminium（11a），隨后環(huán)化生成3，但與TiCorS不同的是，中間產(chǎn)物沒有從活性位點釋放出來。此外，3在酸性條件下可以開環(huán)形成11a。CD光譜顯示TiCorS生成(?)-16-carbomethoxycleavamine（10），這是由CrCS生成的對映異構體。

Fig. 3: 16-carbomethoxycleavamine（10）的生成（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

利用對TiCorS環(huán)化產(chǎn)物的了解，作者提出了4的形成機制。從TiCorS活性位點釋放后，11被TiDPAS2進行1,4-還原，進而促進第二次環(huán)化形成4（Fig. 4）。

Fig. 4: (?)-iboga 和 (+)-Ψ-aspidosperma生物堿的可能形成機制（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

對于5的形成機制：TiCorS將1環(huán)化到11，并將其從活性位點釋放，在活性位點上，它被TiDPAS1通過1,2-還原反應還原至10，然后被PAS再氧化。生成的中間產(chǎn)物會自發(fā)環(huán)化形成5。9是由PAS氧化雙還原(?)-16-dihydrocarbomethoxycleavamine（12）形成的（Fig. 4）。4和5之間的轉(zhuǎn)化最終取決于DPAS催化1,4-還原反應還是1,2-還原反應。實驗pH條件或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的變化可能是有利于1,2-還原反應而不是1,4-還原反應的原因。另外，一種尚未發(fā)現(xiàn)的在生理pH下產(chǎn)生4的還原酶可能決定著T. iboga中這種化合物的生物合成。