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由于免疫測定具有高靈敏度和選擇性，使它們對于檢測不同應(yīng)用中的不同生物分子特別有用。傳統(tǒng)的免疫傳感器基于三明治測定形式，將兩種抗體結(jié)合到目標(biāo)分析物的不同區(qū)域，并將特定識別抗體轉(zhuǎn)換為物理上可檢測的電子或光學(xué)信號。通常通過用化學(xué)試劑修飾換能器表面來實現(xiàn)捕獲抗體受體與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)合。作者報道了一種新的生物電子親和傳感策略，該策略將天然細胞膜作為識別層，作為傳統(tǒng)免疫測定中有吸引力的抗體受體替代品。細胞膜涂層技術(shù)構(gòu)成了一種能夠在合成材料或設(shè)備上復(fù)制細胞膜的豐富生物功能的強大策略。天然細胞膜涂層保留了細胞膜上膜蛋白和脂質(zhì)，因此賦予涂層裝置具有與生物系統(tǒng)交互的獨特性能，包括捕獲和分離生物靶標(biāo)以及阻止非特異性吸附。

在這項工作中，作者衍生了巨噬細胞膜，將它們涂在電化學(xué)傳感器上，并檢查了它們在檢測膜親和性生物分子方面的性能（圖1A）。由于腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 在許多炎癥性疾病中發(fā)揮著重要作用，因此作者選擇其作為模型分析物。在該仿生平臺中，TNF-α的特異性檢測依賴于巨噬細胞膜識別層上的天然TNF-α受體和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗TNF-α檢測抗體（HRP-Ab）。為了防止非特異性結(jié)合，作者進一步將巨噬細胞膜與紅細胞膜融合，并使用混合膜對傳感器進行功能化。具體來說，混合細胞膜功能化的金電極芯片用于基于單樣品孵育的TNF-α親和力測定，其中靶細胞因子被細胞膜上TNF-α受體選擇性捕獲，隨后被HRP-Ab標(biāo)記。這種三明治模式的細胞膜實驗采用3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)/H₂O₂作為介體/底物氧化還原檢測系統(tǒng)。在靶標(biāo)TNF-α存在下，被捕獲的HRP酶在H₂O₂的支持下催化TMB氧化，隨后被氧化的TMB通過電化學(xué)還原反應(yīng)恢復(fù)到原始狀態(tài)。實驗得到的還原電流與傳感器表面捕獲的HRP-Ab量相關(guān)，同時還與目標(biāo)TNF-α的水平成正比。為了區(qū)分空白與目標(biāo)TNF-α，常用的TMB/HRP/ H₂O₂比色法需要幾分鐘氧化溶液中的TMB；然而，在電流分析中， 在施加恒定電位（-0.1 V）150秒后，氧化的TMB被選擇性地還原。在這種檢測過程中，結(jié)合在傳感器表面的HRP-Ab會迅速氧化TMB，進而促進電化學(xué)信號變化。作者通過蛋白質(zhì)印跡分析證實了巨噬細胞膜上存在TNF-α受體（圖 1B )。如圖C，傳感器對10 nM的TNF-α具有超靈敏和選擇性的檢測，而對過量(300nM)的其它細胞因子的響應(yīng)可忽略不計，并能夠檢測低至500 pM的TNF-α。

圖1. 基于細胞膜的TNF-α 檢測的生物電子親和傳感器。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

作者通過三步制備了基于細胞膜的生物電子傳感器芯片（圖2A）。首先，將純化的紅細胞和巨噬細胞膜超聲，并融合生成混合膜囊泡。隨后，為了在工作電極區(qū)域產(chǎn)生均勻的生物膜涂層（不覆蓋參考電極），將調(diào)整體積后的囊泡30 mL懸浮液滴鑄到鍍金電極上。此外，作者還通過調(diào)整囊泡負載和混合膜涂層組成，探索了巨噬細胞/紅細胞混合膜的協(xié)同功能?？紤]到包括TNF-α在內(nèi)的許多血清蛋白都含有巰基，可以與傳感器芯片表面進行非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽性信號。為了抑制非特異性結(jié)合，作者使用紅細胞膜衍生囊泡覆蓋電極，并通過優(yōu)化細胞膜負載有效實現(xiàn)抗生物污染的效果（圖2B）。 在PBB（含有1%BSA的磷酸鹽緩沖液）溶液中，用計時安培法評估金表面HRP-Ab和TNF-α蛋白的非特異性吸附水平。在沒有和存在高濃度TNF-α的情況下，測試了未涂層和涂有不同RBC膜濃度的傳感器芯片性能。結(jié)果顯示，當(dāng)金表面涂覆大量的膜，可以更好地防止不需要的蛋白質(zhì)吸附。0.05 mg/mL（1.5μg）的膜負荷能夠使最小附著量HRP Ab和TNF-α蛋白所產(chǎn)生的信號空白（S/B）比值變化到達平臺。接下來，優(yōu)化兩種膜的混合比例，用于高靈敏度檢測細胞因子（圖2C）。具體來說，在沒有和存在100 nM的TNF-α情況下，測量了生物傳感器上混合膜涂層的中兩種膜的比例從0:1（100%RBC）到1:0（100%巨噬細胞）時，S/B比率值的變化，這是由于巨噬細胞含有TNF-α受體，隨著巨噬細胞的增加，更多的TNF-α/HRP-Ab結(jié)合物被捕捉到傳感器表面上，導(dǎo)致其敏感性增加（圖2C）。因此，作者選擇巨噬細胞/紅細胞膜比為3:1的混合細胞膜制備TNF-α生物傳感器，該傳感器包含足夠數(shù)量的TNF-α受體用于檢測，以及足夠數(shù)量的紅細胞膜用于防止非特異性吸附。

圖2. MΦ/RBC混合膜涂層生物電子傳感器芯片的制造和優(yōu)化。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

作者使用雙熒光圖像來驗證金電極表面上的囊泡融合（圖3A）。實驗分別使用DiI和DiO標(biāo)記巨噬細胞和紅細胞膜，結(jié)果表明在金片上形成了高度均勻的混合細胞膜涂層。此外，SEM表征進一步驗證裸金電極表面通過滴注法形成細胞膜涂層的穩(wěn)定性（圖3B）。結(jié)果表明，與粒狀金表面相比，生物膜表面覆蓋率更高。隨后，對不同的細胞膜涂層方法進行檢測，通過使用高電荷轉(zhuǎn)移電阻值證實滴注法是最有效的方法（圖3C）。在評估操作特性后，對生物電子芯片的制造及TNF-α的生物檢測重復(fù)性通過比較五個獨立測量5 nM TNF-α計時安培標(biāo)準(zhǔn)值進行評估（圖3D）。為了調(diào)查細胞膜涂層芯片的物理特性，作者通過AFM分析研究了細胞膜涂層的形態(tài)（圖3E），觀察到混合膜涂層的平均厚度約為50 nm。

圖3. 混合細胞膜生物電子傳感器芯片的表征。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

在優(yōu)化生物膜組成后，作者測試了混合膜涂層生物電子傳感器對不同的納米級濃度TNF-α的檢測能力。首先使用PBB培養(yǎng)基對生物傳感器的靈敏度進行評估。實驗檢測了不同孵育時間下，不同濃度TNF-α的響應(yīng)信號（圖4A）。隨后構(gòu)建了TNF-α校準(zhǔn)曲線（R²=0.9985），證實了基于細胞膜生物傳感器可以在5分鐘內(nèi)快速捕獲TNF-α并產(chǎn)生可測量的信號。作者還評估TNF-α檢測傳感器的選擇性，研究了其他細胞因子對電流信號的影響。結(jié)果證實，修飾的生物膜有足夠的TNF-α結(jié)合位點，因此，檢測不受高IL-6濃度的影響。同時，作者證實了該傳感器可以在多細胞因子樣本矩陣中實現(xiàn)對TNF-β細胞因子的選擇性檢測（圖4B）。

圖4. 緩沖溶液中TNF-α的校正曲線。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)