KRAS原癌基因的體細(xì)胞突變是人類癌癥中主要的致癌病變。盡管KRAS在歷史上被認(rèn)為是“undruggable”的靶點(diǎn)，但最近成功開發(fā)的共價(jià)K-Ras（G12C）配體已經(jīng)證明了直接、等位基因特異性的K-Ras抑制所帶來的顯著臨床益處。這些K-Ras（G12C）抑制劑利用突變型半胱氨酸的強(qiáng)親核性，不可逆地結(jié)合在K-Ras的Switch II區(qū)域。然而，K-Ras的許多頻繁發(fā)生的體細(xì)胞突變不會(huì)產(chǎn)生半胱氨酸殘基，而對(duì)這些突變體的選擇性靶向仍然是一個(gè)未解決的挑戰(zhàn)。但是，在17%的胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）患者中發(fā)現(xiàn)了這種熱點(diǎn)突變之一——KRAS p.G12R。因此，作者推斷，對(duì)獲得的精氨酸（Arg12）的共價(jià)結(jié)合可以賦予效力和選擇性，并能夠直接靶向K-Ras（G12R）。然而，在生理pH值（pKa3 = 12.5）下完全質(zhì)子化的精氨酸的胍基團(tuán)是弱親核的。為了實(shí)現(xiàn)突變精氨酸的化學(xué)選擇性靶向，作者首先考慮了優(yōu)先與胍或脒反應(yīng)的官能團(tuán)。例如，已發(fā)現(xiàn)2,3-丁二酮，1,2-環(huán)己二酮可選擇性地修飾蛋白質(zhì)上的精氨酸殘基。雖然這些試劑已被用于研究蛋白質(zhì)糖基化，非特異性修飾蛋白質(zhì)并進(jìn)行生物偶聯(lián)反應(yīng)，但這種反應(yīng)性尚未用于靶向共價(jià)配體。首先，作者合成得到具有α,β-二酮酰胺的化合物3。可能由于α-酮的強(qiáng)親電性，化合物3只能作為水合物分離。化合物3在一定pH范圍內(nèi)的水性緩沖液中是穩(wěn)定的，并且不與常見的含硫醇親核試劑反應(yīng)。然而，當(dāng)將100 μM化合物3（分子量 = 674 Da）與重組K-Ras（G12R）GDP（GDP = 鳥苷二磷酸）在pH 7.5和23 °C下孵育并通過蛋白質(zhì)質(zhì)譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)時(shí)，作者觀察到兩種新蛋白質(zhì)種類的形成，其分子量與化學(xué)計(jì)量共價(jià)加合物一致，損失一或兩個(gè)當(dāng)量的水（分別為+ 656 Da和+ 638 Da，F(xiàn)ig. 1C）。確認(rèn)K-Ras Switch-II配體在配備鄰位二羰基系統(tǒng)時(shí)與K-Ras（G12R）中的Arg12的反應(yīng)性。Fig. 1: α,β-二酮酰胺3的合成，與精氨酸殘基反應(yīng)機(jī)理以及K-Ras（G12R）GDP和K-Ras（G12R） GDP 3加合物的全蛋白質(zhì)質(zhì)譜。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）在pH 7.5下延長(zhǎng)孵育后，化合物3未能對(duì)野生型（WT） K-Ras·GDP（Fig. 2A）或其它熱點(diǎn)突變體產(chǎn)生修飾，包括G12D、G12V、Q61R、Q61K 和 Q61L（Fig. 2B），證實(shí)了其與Arg12的選擇性修飾。此外，K-Ras含有幾個(gè)表面暴露的精氨酸，它們沒有被化合物3修飾，進(jìn)一步支持了它對(duì)突變精氨酸的選擇性。與該配體骨架對(duì)GDP結(jié)合狀態(tài)的蛋白質(zhì)偏好一致，化合物3與K-Ras（G12R）GppNHp的反應(yīng)比較緩慢，72小時(shí)的修飾效率為<5%（Fig. 2A）。該反應(yīng)依賴于pH值，在pH值6時(shí)反應(yīng)速率大幅度降低，在在pH值8時(shí)反應(yīng)速率達(dá)到最大值（Fig. 2C）。與未修飾的K-Ras（G12R）GDP相比，K-Ras（G12R）GDP·3加合物的熱穩(wěn)定性顯著提高（Fig. 2D），熔融溫度升高了9.1 °C，且這種加合物的形成也似乎是不可逆的。Fig. 2: 化合物3的選擇性以及在不同pH條件下的反應(yīng)速率。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）為了了解Arg12和α,β-二酮酰胺之間形成的加合物的化學(xué)性質(zhì)，作者得到了K-Ras（G12R）·GDP和化合物4的共晶體（化合物3的結(jié)構(gòu)類似物）?；衔?/span>4結(jié)合在K-Ras的Switch II口袋中，配體和蛋白質(zhì)之間的共價(jià)鍵具有明確的電子密度（Fig. 3A）。其中，作者驚奇地觀察到了一種咪唑鎓結(jié)構(gòu)，Arg12以其ε和η氮參與“側(cè)向”取向。這種咪唑加合物與全蛋白質(zhì)質(zhì)譜法揭示的兩個(gè)水分子的損失一致（Fig. 1C）。來自η氮的親核加成也似乎是立體選擇性的，因?yàn)殡娮用芏惹宄乇砻魇宕际?/span>S-構(gòu)型（Fig. 3A，B）。與未配位的K-Ras（G12R）GDP相比，Arg12的側(cè)鏈向Switch II區(qū)域靠攏，Cβ-Cγ-Cδ-Nε二面角由反向左轉(zhuǎn)（Fig. 3C）。Fig. 3: K-Ras（G12R）GDP·4加合物的晶體結(jié)構(gòu)。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）此外，為了進(jìn)一步確認(rèn)3和Arg12之間的反應(yīng)是否會(huì)導(dǎo)致K-Ras（G12R）的功能性抑制。作者測(cè)試了K-Ras（G12R）與3結(jié)合前后核苷酸交換活性，發(fā)現(xiàn)熒光GDP類似物（BODIPY-GDP）在有Sos蛋白或乙二胺四乙酸(EDTA)的情況下交換未標(biāo)記的GDP（Fig. 4A）。最后，作者利用K-Ras和3之間反應(yīng)時(shí)分子量的增加在抗Ras免疫印跡上進(jìn)行展示(Fig. 4B)，驗(yàn)證了精氨酸靶向親電試劑在復(fù)雜蛋白質(zhì)組中對(duì)K-Ras的共價(jià)修飾。同時(shí)，作者也觀察到化合物3僅能對(duì)外源重組蛋白K-Ras（G12R）·GDP實(shí)現(xiàn)完全修飾（Fig. 4B），表明了化合物3在細(xì)胞裂解物中保持活性，但不能與內(nèi)源性K-Ras（G12R）結(jié)合。主要是由于與已被GDP狀態(tài)選擇性配體成功靶向的K-Ras（G12C）不同，K-Ras（G12R）嚴(yán)重?fù)p害了GTPase活性，從而阻止其轉(zhuǎn)化為敏感的GDP結(jié)合狀態(tài)。Fig. 4: (A)Sos蛋白或EDTA介導(dǎo)的K-Ras（G12R）和K-Ras（G12R）3加合物的核苷酸交換。(B)細(xì)胞裂解物中內(nèi)源性和外源性K-Ras（G12R）的共價(jià)修飾。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
Ziyang Zhang和Kevan M. Shokat團(tuán)隊(duì)使用α,β-二酮酰胺作為優(yōu)先的精氨酸反應(yīng)性官能團(tuán)，確定了K-Ras（G12R）的第一個(gè)選擇性突變共價(jià)配體。發(fā)現(xiàn)這些配體與K-Ras（G12R）產(chǎn)生穩(wěn)定的咪唑鎓加合物，并使用X-射線晶體學(xué)直接觀察到一種此類加合物的結(jié)構(gòu)。作者成功地將其用于設(shè)計(jì)與復(fù)雜蛋白質(zhì)組中的弱親核精氨酸殘基結(jié)合的靶向共價(jià)配體，其可以作為治療靶向人類疾病中獲得性精氨酸殘基的基礎(chǔ)。
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