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熒光納米顯微成像技術(shù)由于非侵入性、特異性強(qiáng)、分辨率高（納米級(jí)）等特點(diǎn)，被廣泛用來觀察生物樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。化學(xué)特異性熒光探針和“開-關(guān)”型熒光探針則為該技術(shù)的核心。光激活染料和籠狀染料在光的誘導(dǎo)下就可以發(fā)生可逆的熒光“開-關(guān)”轉(zhuǎn)換，省去了特定的成像緩沖溶液以及高強(qiáng)度的紫外激發(fā)光，因而被廣泛應(yīng)用于單分子成像顯微鏡當(dāng)中，如光激活定位顯微鏡（PALM）和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡（STORM）。羅丹明染料因具有性能可調(diào)、細(xì)胞膜通透性好、亮度高和光穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)而備受青睞。然而，已報(bào)道得的羅丹明的“籠閉”策略是依賴于“鎖住”染料分子使其不發(fā)光。一種是在氮原子上引入“光不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)”，另外一種是將內(nèi)酯環(huán)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的環(huán)狀α-重氮酮。前者會(huì)限制分子的取代方式，造成化合物水溶性變差、潛在的光毒性的問題，而后者會(huì)面臨非熒光副產(chǎn)物的形成以及潛在有毒副產(chǎn)物等問題。因此，發(fā)展無“籠閉”基團(tuán)、光激活效率高以及生物相容性好的熒光團(tuán)用于熒光顯微鏡和納米顯微鏡具有重要意義。本文中，作者合成了一系列功能化的氧雜蒽酮化合物，在單光子或者雙光子激發(fā)下，分子會(huì)高效地轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的二氫吡喃環(huán)派若寧染料。PaX染料通過三步合成即可被簡(jiǎn)易制備，該策略可擴(kuò)展到碳和硅橋聯(lián)的氧雜蒽酮類似物，得到一系列跨越大部分可見光譜的光激活熒光標(biāo)簽。其中，PaX衍生物硅-派若寧染料展現(xiàn)了良好的生物相容性和優(yōu)異的光穩(wěn)定性。最后，作者還成功地將PaX染料用于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡和超分辨顯微鏡的細(xì)胞成像當(dāng)中。

作者利用光化學(xué)反應(yīng)去組裝或者“鎖住”熒光團(tuán)而不是“解鎖”光不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)”的策略制備得到了新型籠狀的羅丹明染料（Figure 1a）。通過在氧雜蒽酮骨架上引入合適的分子內(nèi)自由基捕獲基團(tuán)，二芳基酮和自由基捕獲基團(tuán)（苯乙烯）通過光觸發(fā)級(jí)聯(lián)途徑可以光組裝為9-烷氧派若寧熒光團(tuán)（Figure 1b）。為了研究自由基受體的取代作用，作者進(jìn)一步合成了一系列光激活硅-派若寧染料（Figure 1c）。其中，化合物1-6在400 nm處具有較強(qiáng)的吸收峰。在光激活下，化合物1-6在質(zhì)子溶劑中（如100 mM, pH=7的磷酸鹽緩沖溶液）會(huì)經(jīng)歷快速且完全的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化，表現(xiàn)為明亮的發(fā)射（Figure 1d）。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得，乙烯基取代的化合物1的光激活速率最慢，隨著烯烴取代基團(tuán)的增加，化合物4的速率最高，這可能是因?yàn)棣?甲基取代基對(duì)烯烴的誘導(dǎo)作用（Figure 1e）。此外，作者還對(duì)進(jìn)一步修飾的PaX染料化合物9-12進(jìn)行了光激活速率的測(cè)試，化合物11的速率較高（Figure 1f），并得到其在一系列生理環(huán)境pH值下的光激活速率（Figure 1g）。最后，作者還測(cè)試了化合物11的光學(xué)穩(wěn)定性，性能要優(yōu)于商用染料（Figure 1h）。

Figure 1.  PaX染料的設(shè)計(jì)合成及表征（圖片來源：Nat. Chem.）

接下來作者探究了上述化合物在生物成像中的應(yīng)用（Figure 2）。通過在PaX₅₆₀分子上偶聯(lián)具有氨基反應(yīng)活性的N-羥基丁二酰亞胺基團(tuán)，可將其用于靶向色氨酸上的-NH₂基團(tuán)，因此得到了PaX₂₆₀-NHS探針。并分別進(jìn)行了STED和PALM超分辨成像。同時(shí)，在PaX₅₆₀分子上偶聯(lián)具有巰基反應(yīng)活性的馬來酰亞胺基團(tuán)，得到的PaX₄₈₀, PaX₅₂₅ 和PaX₊₅₆₀探針可用于靶向色氨酸中的-SH基團(tuán)。對(duì)于固定細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的標(biāo)記，在PaX₅₆₀分子上偶聯(lián)鬼筆環(huán)肽（phalloidin），制備的PaX₂₆₀-phalloidin探針可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的STED和PALM超分辨成像。

Figure 2. 光激活染料用于光學(xué)成像（圖片來源：Nat. Chem.）

為了評(píng)估PaX染料用于活細(xì)胞成像的光激發(fā)機(jī)制，作者制備了分別帶有線粒體和溶酶體靶向基團(tuán)的染料PaX₅₆₀-Mito和PaX₅₆₀-Lyso（Figure 3a和b）。數(shù)據(jù)表明，在較高和較低的pH值條件下，兩種染料都具有良好的細(xì)胞器靶向性和光激活特性。同時(shí)，作者還制備了Halo Tag特異性的氯烷烴衍生物（PaX₅₆₀-Halo）和SNAP特異性的O⁶ -芐基鳥嘌呤衍生物（PaX₅₆₀-SNAP），并得到了PaX₅₆₀-Halo 標(biāo)記的U2OS細(xì)胞中波形蛋白的雙光子共聚焦圖像以及STED圖像（Figure 3c-f）。

此外，在405 nm激光的照射下，PaX₅₆₀-Halo 和AL-560探針可實(shí)現(xiàn)在單個(gè)激發(fā)/檢測(cè)通道下對(duì)U2OS細(xì)胞中的微管蛋白和波形蛋白的共聚焦多色成像（Figure 4a-e）。

Figure 3. 光激活PaX染料用于活細(xì)胞成像（圖片來源：Nat. Chem.）

Figure 4.  PaX染料用于雙通道成像（圖片來源：Nat. Chem.）

另外，作者將化合物21和22用于活細(xì)胞SMLM成像當(dāng)中（Figure 5）。所得到的圖像均可顯示明顯的蛋白形貌，說明PaX染料可以進(jìn)行有效的細(xì)胞標(biāo)記和檢測(cè)。最后，作者還將偶聯(lián)抗體的化合物14成功用于對(duì)HeLa-Kyoto細(xì)胞的MINFLUX成像當(dāng)中（Figure 6），平均標(biāo)記精度可以達(dá)到3.7 nm。

Figure 5. 自標(biāo)記PaX₅₆₀底物對(duì)活細(xì)胞的PALM成像（圖片來源：Nat. Chem.）

Figure 6.  PaX₅₆₀底物對(duì)細(xì)胞的MINFLUX成像（圖片來源：Nat. Chem.）