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Angew.北大王晶團(tuán)隊(duì)通過發(fā)展比例型熒光生物傳感器揭示線粒體內(nèi)GTP/GDP Ratio的動態(tài)調(diào)控

來源：北京大學(xué)      2022-06-30
導(dǎo)讀：近日，北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王晶團(tuán)隊(duì)在學(xué)術(shù)期刊《Angewandte Chemie International Edition》發(fā)表了題為“Monitoring the Dynamic Regulation of the Mitochondrial GTP-to-GDP Ratio with a Genetically Encoded Fluorescent Biosensor”（開發(fā)遺傳編碼的生物熒光探針監(jiān)測線粒體中GTP與GDP比值的動態(tài)變化）的研究工作。

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GTP和GDP的代謝和轉(zhuǎn)化在廣泛的生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠?yàn)樯锖铣商峁┠芰?，或參與廣泛的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。GTP和GDP的代謝和轉(zhuǎn)化廣泛存在于這些相關(guān)的生理過程或病理過程中，通常由復(fù)雜的酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)，因而GTP/GDP比值可以作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量代謝狀態(tài)變化的敏感且重要的指標(biāo)。然而，針對GTP和GDP比值指標(biāo)的活細(xì)胞動態(tài)監(jiān)測始終是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的難題。更為重要的是，相比較檢測GTP或GDP絕對濃度獲得的能量代謝的信息，精準(zhǔn)檢測細(xì)胞內(nèi)GTP與GDP的相對濃度可以更好地解釋鳥苷酸能量代謝變化的生物學(xué)意義。因此，發(fā)展一種光學(xué)工具來實(shí)時(shí)報(bào)告活細(xì)胞的GTP/GDP比率具有非常重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

基于此，北京大學(xué)藥學(xué)院王晶團(tuán)隊(duì)，利用遺傳編碼的熒光蛋白傳感器技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對GTP/GDP比率的時(shí)空特異性和實(shí)時(shí)動態(tài)監(jiān)測。探針設(shè)計(jì)選擇Ct-eIF5B的結(jié)構(gòu)域Ⅰ作為“GTP/GDP感知元件”，繼而將“報(bào)告元件”循環(huán)重排黃色熒光蛋白（cpYFP）插入到Ct-EIF5B的結(jié)構(gòu)域Ⅰ中，cpYFP會對其N端或C端的蛋白結(jié)構(gòu)變化敏感，當(dāng)GTP或GDP與該融合蛋白（GRIser）結(jié)合后，會誘導(dǎo)蛋白構(gòu)象變化，從而產(chǎn)生相應(yīng)的熒光信號。
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此外本研究利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和蛋白分子定向進(jìn)化技術(shù)，對該GTP/GDP比值的熒光探針進(jìn)行了深度優(yōu)化。通過對突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)高效完整的篩選工作流程，并綜合評價(jià)各個(gè)突變體的響應(yīng)幅度、親和力等體外特征，開發(fā)了性能優(yōu)良的遺傳編碼的GTP/GDP比值的熒光探針（GRIserHR）。GRIserHR具有極好的熒光穩(wěn)定性、選擇性和敏感性（亞微摩爾）。隨后，該團(tuán)隊(duì)通過引入適當(dāng)?shù)男盘栯呐c傳感器融合，構(gòu)建得到GRIserHR的突變體，從而實(shí)現(xiàn)了對活細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞區(qū)室中的GTP/GDP比值的監(jiān)測，為實(shí)時(shí)動態(tài)研究活細(xì)胞中亞細(xì)胞尺度的GTP/GDP比值奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
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同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)還將GRIserHR用于探究PEPCK-M和SCS酶功能擾動后是如何差異性地調(diào)控胞質(zhì)和線粒體GTP/GDP比值的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明線粒體中GTP/GDP比值獨(dú)立于細(xì)胞質(zhì)GTP/GDP比值的變化?？傊?/span>GRIserHR探針可以加強(qiáng)對線粒體代謝機(jī)制的深入理解，以及通過發(fā)現(xiàn)影響 GTP-GDP相互轉(zhuǎn)換的特異性靶標(biāo)，展開激活劑和抑制劑的高通量篩選工作。本工作也為GTP/GDP比值作為代謝動態(tài)指標(biāo)提供了確鑿的證據(jù)，進(jìn)一步完善了中心碳代謝分子研究的監(jiān)測工具庫。
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北京大學(xué)藥學(xué)院研究員王晶研究員為本研究論文的通訊作者。北京大學(xué)藥學(xué)院博士研究生張美琪和北京大學(xué)藥學(xué)院六年制研究生楊波為論文的共同第一作者。該工作得到科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和國家自然科學(xué)基金委等項(xiàng)目資助。
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左起：張美琪（博士研究生），王晶（研究員），楊波（六年制碩士研究生）
原文鏈接：https://doi.org/10.1002/anie.202201266
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王晶，博士，北京大學(xué)藥學(xué)院研究員、博士生導(dǎo)師、天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室PI。入選國家海外高層次人才計(jì)劃。長期致力于利用化學(xué)生物學(xué)方法研究小分子對生物大分子的調(diào)控機(jī)制和開發(fā)相應(yīng)的基于遺傳編碼的生物熒光探針。至今以第一作者或通訊作者身份在Nat. Chem.、Nat. Biotechnol.、Angew. Chem. Int. Ed. 等國際重要學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文。



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