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膽汁酸受體TGR5（Takeda G protein-coupled receptor 5）在血糖穩(wěn)態(tài)、能量消耗和肝臟保護(hù)等方面起重要作用，是一個(gè)極具潛力的治療代謝綜合征及炎癥性疾病的藥物靶點(diǎn)。然而，多種已報(bào)道的TGR5激動(dòng)劑在人和小鼠體內(nèi)存在較大的活性差異，利用現(xiàn)有的嚙齒類動(dòng)物模型開展化合物藥效學(xué)和毒理學(xué)研究會(huì)產(chǎn)生偏差。近日，中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)鼠源TGR5中的第88位組氨酸（人源TGR5中的第89位酪氨酸）是造成人鼠受體活性差異的關(guān)鍵，進(jìn)而利用CRISPR-Cas9構(gòu)建了TGR5^H88Y人源化小鼠模型，并利用該模型驗(yàn)證了白樺脂酸類衍生物11d-Na是一個(gè)體內(nèi)體外藥理藥效優(yōu)異的TGR5激動(dòng)劑。相關(guān)成果發(fā)表在J. Med. Chem.上。

　　膽汁酸是兩親性的類固醇，由肝臟合成后儲(chǔ)存于膽囊，膽汁酸除了參與食物來源脂質(zhì)消化吸收以外，也作為體內(nèi)的的信號(hào)分子，在血糖穩(wěn)態(tài)，脂質(zhì)調(diào)節(jié)，能量代謝等方面發(fā)揮重要的功能。膽汁酸在體內(nèi)可激活核受體FXR（farnesoid X receptor）及膜受體TGR5（Takeda G protein-coupled receptor 5）。TGR5也被稱為G蛋白膽汁酸偶聯(lián)受體1（G protein-coupled bile acid receptor 1，GPBAR1），與G_αs相偶聯(lián)，廣泛表達(dá)于多種的細(xì)胞類型。TGR5的激活不僅可以直接刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素，也可作用于腸內(nèi)分泌細(xì)胞，通過促進(jìn)GLP-1（glucagon-like peptide 1）的分泌，以間接的方式作用于胰島素的分泌，因而成為備受關(guān)注糖尿病藥物的靶點(diǎn)。

　　然而，在TGR5激動(dòng)劑的開發(fā)中，許多化合物在鼠源的TGR5受體（mTGR5）上的活性和在人源的TGR5（hTGR5）上相比有顯著差異，而在犬受體（cTGR5）上的活性則與人相當(dāng)。研究團(tuán)隊(duì)前期發(fā)現(xiàn)白樺脂酸類化合物在各種屬TGR5上的活性差異尤為明顯，這就意味著利用現(xiàn)有的嚙齒類動(dòng)物模型開展化合物藥效學(xué)和毒理學(xué)研究會(huì)產(chǎn)生偏差。為了解決這一問題，研究人員從TGR5種屬差異入手，通過比對(duì)不同種屬的TGR5序列，重點(diǎn)關(guān)注了在人源和犬源受體上氨基酸相同，但在鼠源受體上不同的位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)鼠源受體中的第88位的組氨酸是一個(gè)影響其活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。研究人員將該位置上的組氨酸突變?yōu)槿嗽?犬源受體中的酪氨酸之后，多類化合物尤其是白樺脂酸類衍生物在mTGR5^H88Y突變體上的活性顯著提升，與hTGR5上的活性差異大大減小。隨后研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)在小鼠中引入了這一突變，構(gòu)建了TGR5^H88Y人源化小鼠，這為后續(xù)藥效學(xué)研究提供了便利。

圖1 通過CRISPR-Cas9構(gòu)建TGR5^H88Y人源化小鼠

　　同時(shí)，研究人員以白樺脂酸類TGR5激動(dòng)劑XYT528B為起點(diǎn)，通過對(duì)C3位改造，得到了活性更優(yōu)異代謝更穩(wěn)定的氨基甲酸酯結(jié)構(gòu)3d，并且用docking解釋了活性增強(qiáng)的原因，即氨基甲酸酯中的羰基O和NH分別與hTGR5中Tyr240和Ser247形成氫鍵相互作用；C17羧基為活性保持所必需，任何改變都會(huì)使活性出現(xiàn)明顯下降；而對(duì)于C20位的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到的活性最好的化合物11d，其在hTGR5上活性較INT777提高近20倍。

　　考慮到三萜類化合物固有的理化性質(zhì)缺陷，研究人員采取成鹽的方式得到溶解度和滲透性大幅提升的化合物11d-Na（hTGR5 EC₅₀ = 6.81 ± 1.8 nM）。在TGR5^H88Y人源化小鼠模型上進(jìn)行的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中，11d-Na表現(xiàn)出良好的改善糖耐量的活性，也顯著提升了給予葡萄糖后突變鼠體內(nèi)的胰島素和GLP-1的分泌水平（在野生型小鼠模型中難以觀察到11d-Na的降糖活性）。

圖2 化合物11d-Na在體外和體內(nèi)TGR5^H88Y上表現(xiàn)出更好的活性

　　綜上所述，此研究闡明了小鼠TGR5中第88位組氨酸（人源TGR5中第89位酪氨酸）是造成TGR5活性種屬差異的關(guān)鍵位點(diǎn)，通過CRISPR/Cas9將mTGR5相應(yīng)的第88位組氨酸被替換為酪氨酸，成功構(gòu)建了TGR5^H88Y人源化小鼠。通過此人源化模型，研究者成功發(fā)現(xiàn)了體內(nèi)體外活性及理化性質(zhì)顯著提升的白樺脂酸衍生物11d-Na，為進(jìn)一步獲得高質(zhì)量高成藥性TGR5激動(dòng)劑奠定了基礎(chǔ)。

　　上海藥物所博士生贠盈、上海藥物所博士后張晨露以及南京中醫(yī)藥大學(xué)與上海藥物所聯(lián)合培養(yǎng)博士生郭世猛為該論文共同第一作者。南發(fā)俊研究員和謝欣研究員為共同通訊作者。該工作獲得包括國(guó)家自然科學(xué)基金委、上海市科委、中科院先導(dǎo)專項(xiàng)以及山東省自然科學(xué)基金的支持。

　　原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.1c00851

參考資料：http://www.simm.ac.cn/web/xwzx/kydt/202108/t20210824_6167398.html