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對(duì)生物活性分子進(jìn)行成像能夠幫助我們理解其結(jié)構(gòu)的多樣性及其發(fā)揮生理活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在亞納米分辨率下通過(guò)冷凍電鏡技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行成像已經(jīng)為人們對(duì)蛋白質(zhì)的理解提供了關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)信息。但與結(jié)構(gòu)呈嚴(yán)格線性的蛋白質(zhì)及核酸不同，寡糖與多糖中的單糖具有多個(gè)鏈接位點(diǎn)，且每個(gè)位點(diǎn)都存在α及β異構(gòu)體。隨著技術(shù)手段日新月異，離子遷移質(zhì)譜與冷凍紅外光譜技術(shù)極大地促進(jìn)了寡糖及多糖的分析，但這些分析手段都是基于分子系綜的平均態(tài)，無(wú)法對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行分析，而通過(guò)隧道掃描顯微鏡技術(shù)(scanning tunnelling microscopy, STM)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單一分子的精準(zhǔn)成像，最近，德國(guó)馬克思-普朗克固體研究所與馬克思-普朗克膠體與界面研究所的K. Kern教授，P. H. Seeberger教授與S. Rauschenbach教授開(kāi)創(chuàng)性地利用STM實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同連接的直鏈與支鏈寡糖及多糖的精準(zhǔn)成像，并對(duì)其連接與構(gòu)象進(jìn)行了分析，為糖組學(xué)及糖密碼的研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，相關(guān)成果發(fā)表在Nature（DOI: 10.1038/s41586-020-2362-1）上。

由于可靠的STM實(shí)驗(yàn)需要嚴(yán)格控制環(huán)境為超高真空(ultrahigh vacuum, UHV)以減少表面雜質(zhì)的影響，因此，用于分析的糖苷樣品需要通過(guò)電噴霧離子束沉積技術(shù)(ES-IBD)制備。將ES-IBD技術(shù)與STM技術(shù)結(jié)合以進(jìn)行分子成像已被廣泛應(yīng)用于包括染料、多肽、蛋白以及二糖等多種非揮發(fā)物質(zhì)的分析。氣態(tài)的分子離子束糖苷隨后在飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)器監(jiān)測(cè)下通過(guò)核質(zhì)比分選器純化以進(jìn)行成像(Fig.1a)。該方法的顯著優(yōu)勢(shì)在于其樣品需求量少，僅需要數(shù)微克就可以完成樣品的制備及分析。作者通過(guò)自動(dòng)合成儀合成了一系列結(jié)構(gòu)明確的寡糖及多糖，并在低能電子束(5 eV)下對(duì)其進(jìn)行軟沉積，該溫和過(guò)程可以保證糖苷鍵不被破壞，隨后通過(guò)分子碰撞，糖苷的構(gòu)型得以實(shí)現(xiàn)重組分配。在本實(shí)驗(yàn)中，作者在低溫條件下限制分子運(yùn)動(dòng)，得到了在界面上均勻分布的單一分子，因此，作者可以通過(guò)STM對(duì)分子進(jìn)行進(jìn)一步觀察。

(圖片來(lái)源：Nature)

作者首先對(duì)在還原端連有烷氨基linker的線性α-1,6-甘露五糖，α-1,6-甘露六糖以及β-1,6-葡萄六糖進(jìn)行了分析(Fig.1b, e, h)。在STM成像圖中，不同的糖苷在不同構(gòu)象下具有相近的長(zhǎng)度。低溫條件下，分子熱運(yùn)動(dòng)被消除，因此分子被固定在不同構(gòu)象中。每個(gè)寡糖中的單糖單元以突起的形式被呈現(xiàn)：甘露五糖中包含5個(gè)特征突起而甘露和葡萄六糖中包含6個(gè)特征突起，突起高度在0.15 nm到0.25 nm之間變化，而且每個(gè)突起清晰地被分隔開(kāi)。對(duì)所有1,6-連接的寡糖，單糖之間的距離為0.52 ± 0.07 nm，與糖的構(gòu)型無(wú)關(guān)，烷氨基linker在圖像中呈現(xiàn)為低突起。由于這些數(shù)值與二糖的STM圖像相符，作者將這些數(shù)值用作進(jìn)一步研究糖苷鍵的標(biāo)準(zhǔn)指數(shù)。

為驗(yàn)證STM圖像是否能區(qū)分寡糖的連接方式，作者隨后設(shè)計(jì)了支鏈甘露六糖4和5，其中，六糖4中R2和R3殘基分別綴有兩個(gè)單糖殘基，而六糖5中僅在R2殘基上綴有一個(gè)二糖殘基。通過(guò)對(duì)其進(jìn)行STM成像(Fig. 2)，作者發(fā)現(xiàn)STM圖像清晰地展現(xiàn)出了分支結(jié)構(gòu)，六糖4的STM圖像中，兩個(gè)支鏈分布在主鏈兩側(cè)呈接近90度分布，其中α-1,6糖苷鍵的長(zhǎng)度為0.53 ± 0.05 nm，與此前觀察一致，而α-1,2糖苷鍵明顯增長(zhǎng)，為0.61 ± 0.02 nm，這種長(zhǎng)度差異使得六糖中的每個(gè)單元均能被識(shí)別，同時(shí)表明主鏈發(fā)生了輕微扭曲。而寡糖5形狀更加緊湊，這是由于5具有更大的柔韌性，盡管軟沉積可以排除污染，但含較長(zhǎng)支鏈的結(jié)構(gòu)更易發(fā)生折疊掩蓋成像，在STM圖像中，各個(gè)單分子圖像中的突起數(shù)量明顯減少，增加了分析難度。因此，作者僅選取了含正確突起數(shù)量的分子圖像進(jìn)行分析(Fig.2e)，在圖像中，該分子構(gòu)象充分伸展，可以清晰地辨別分支點(diǎn)，通過(guò)對(duì)烷氨基linker進(jìn)行定位后，該分子中每個(gè)單糖殘基均可被識(shí)別。

(圖片來(lái)源：Nature)

該方法同樣適用與具有更大聚合度多糖的精準(zhǔn)成像(Fig.3)。具有三分支結(jié)構(gòu)的十一糖的STM圖像表明所有的分支彼此分離，而且多糖中的每一個(gè)單糖單元都是可見(jiàn)的，因此，多糖中的三個(gè)臂可以通過(guò)其包含的甘露糖殘基數(shù)辨別。α-1,3和α-1,2糖苷鍵的長(zhǎng)度不同，可用于區(qū)分D2和D3臂，進(jìn)而可以確定殼寡糖分支。該分子高度較其他分子而言更高，可能是三個(gè)支鏈空間相互作用的結(jié)果。

(圖片來(lái)源：Nature)

該方法的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于可以使用ES-IBD技術(shù)從寡糖混合物中分選出含特定質(zhì)量的寡糖(Fig.4)，比如，通過(guò)對(duì)核質(zhì)比四級(jí)桿分選器進(jìn)行調(diào)整可以實(shí)現(xiàn)甘露五糖和甘露六糖的準(zhǔn)確分離，隨后可以對(duì)兩種寡糖分別進(jìn)行成像分析。

(圖片來(lái)源：Nature)

總結(jié)：德國(guó)馬克思-普朗克固體研究所的K. Kern教授、S. Rauschenbach教授與馬克思-普朗克膠體與界面研究所的P. H. Seeberger教授共同合作利用STM對(duì)多種寡糖及多糖進(jìn)行了成像分析，為研究聚糖的拓?fù)?，結(jié)構(gòu)和功能提供了化學(xué)選擇性的方法。在低溫條件下以亞納米級(jí)分辨率以可視化手段研究固定構(gòu)象的單一糖苷分子，可防止由于構(gòu)象平均化而導(dǎo)致的信息丟失。經(jīng)過(guò)質(zhì)量分選確保觀察到的幾何形狀和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以明確地與結(jié)構(gòu)特征相關(guān)。在單分子水平上化學(xué)選擇地獲得寡糖的結(jié)構(gòu)信息將為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)糖類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)，在破譯糖代碼的道路上邁出堅(jiān)實(shí)的一步。

撰稿人：H.D.