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帶有胍基側(cè)鏈的精氨酸，作為蛋白質(zhì)中一種關(guān)鍵的基本氨基酸，在酶催化、大分子相互作用、能量代謝及免疫調(diào)節(jié)等生命過程中都發(fā)揮著不可替代的重要作用。然而，相較于半胱氨酸、賴氨酸等其它親核氨基酸，精氨酸的化學(xué)反應(yīng)性較低，難以實現(xiàn)對其高選擇性的共價標(biāo)記。盡管已有一些化學(xué)探針被開發(fā)用于精氨酸標(biāo)記，但其在復(fù)雜的蛋白質(zhì)組環(huán)境中進(jìn)行全局性、定量分析的能力仍然有限，這導(dǎo)致在系統(tǒng)研究精氨酸在蛋白質(zhì)發(fā)揮功能中的作用時面臨著巨大挑戰(zhàn)。

北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北大-清華生命聯(lián)合中心雷曉光教授領(lǐng)銜的科研團(tuán)隊長期致力于開發(fā)新一代高效的生物相容反應(yīng)，通過化學(xué)探針或化學(xué)交聯(lián)劑結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)的功能及結(jié)構(gòu)（JACS 2013, 135, 4996; Elife 2016, 5, e12509; Anal. Chem. 2018, 90, 1195; Nat. Commun. 2019, 10, 3911; Nat. Commun. 2022, 13, 1468）。

近日，該研究團(tuán)隊在《德國應(yīng)用化學(xué)》（Angew. Chem. Int. Ed.）雜志上在線發(fā)表了題為：“Quantitative Reactivity Profiling of Functional Arginine Residues in Human Cancer Cell Line Proteomes”的研究論文（圖1），首次開發(fā)了一種基于特定精氨酸標(biāo)記探針的化學(xué)蛋白質(zhì)組分析方法，成功繪制了人類癌細(xì)胞中精氨酸反應(yīng)性的全景圖譜。該研究不僅介紹了一種可以大規(guī)模對蛋白質(zhì)組中精氨酸殘基進(jìn)行反應(yīng)性分析的方法，還揭示了多個此前未報道的功能性精氨酸位點，為癌癥靶向治療提供了全新思路。

（圖1）論文截圖

在這項研究中，作者使用帶有苯基乙二醛的化學(xué)探針，結(jié)合同位素標(biāo)簽串聯(lián)正交酶切的ABPP技術(shù)（isoTOP-ABPP），成功將該技術(shù)的應(yīng)用范圍擴(kuò)展至功能性精氨酸的系統(tǒng)性全局分析，在四個腫瘤細(xì)胞系中實現(xiàn)了對近17,000個精氨酸的反應(yīng)性定量分析。為進(jìn)一步驗證分析結(jié)果，團(tuán)隊開展了酶活測定、哺乳動物細(xì)胞雙雜交、等溫量熱滴定等一系列實驗，最終確認(rèn)了一批在酶催化和大分子相互作用中，參與功能調(diào)控的重要功能性精氨酸（圖2）。

（圖2）通過isoTOP-ABPP方法定量精氨酸反應(yīng)性并識別功能性精氨酸

研究團(tuán)隊使用帶有炔基的苯基乙二醛探針AP-1，在四種人類癌細(xì)胞系（MDA-MB-231、HepG2、Caco-2、HeLa）中系統(tǒng)性地分析了精氨酸的反應(yīng)性，獲得了涵蓋大量蛋白質(zhì)位點的定量數(shù)據(jù)集。通過比較不同濃度探針標(biāo)記后的同位素比例（R值）來確定氨基酸反應(yīng)性的高低。通過酶活測定、哺乳動物細(xì)胞雙雜交和等溫量熱滴定等驗證手段，團(tuán)隊從識別出的高反應(yīng)活性氨基酸中成功鑒定出多個對酶的催化活性、蛋白-蛋白相互作用、蛋白-核酸相互作用具有重要貢獻(xiàn)的精氨酸殘基。在這些氨基酸上進(jìn)行單點突變即可削弱酶的催化活性或大分子間的相互作用。這其中，乳酸脫氫酶LDHA的R171、LDHB的R172、丙酮酸激酶PKM的R43、肌酸激酶CKB的R341、真核起始因子EIF4A1的R168以及遠(yuǎn)上游元件結(jié)合蛋白FUBP1的R118是新識別出的功能精氨酸位點，此前未被報道。研究團(tuán)隊針對CKB的R341進(jìn)行了更為深入的細(xì)胞生物學(xué)探索，發(fā)現(xiàn)CKB的R341突變可通過抑制CKB活性阻礙肌酸與磷酸肌酸之間的轉(zhuǎn)化，顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移能力。這些結(jié)果共同證明了這項研究開發(fā)的isoTOP-ABPP蛋白質(zhì)組學(xué)方法在精確識別功能性精氨酸殘基方面的強(qiáng)大能力與可行性?；趯DHA上高反應(yīng)性精氨酸位點的深入理解，研究團(tuán)隊進(jìn)一步設(shè)計并合成了靶向LDHA的共價抑制劑ArGO-LDHA-1，該分子表現(xiàn)出對LDHA的強(qiáng)效、不可逆抑制（圖3），為開發(fā)針對精氨酸的共價抑制劑設(shè)計提供了新思路。

（圖3）共價抑制劑ArGO-LDHA-1對LDHA具有強(qiáng)效、持久、不可逆的抑制活性

總體而言，這項研究通過對四種癌細(xì)胞系進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，成功篩選出390個含有高反應(yīng)性精氨酸的蛋白質(zhì)，系統(tǒng)闡釋了功能性精氨酸在多種蛋白發(fā)揮功能中起到的調(diào)控機(jī)制，極大深化了對其在腫瘤發(fā)生中多功能角色的理解，填補(bǔ)了親核氨基酸化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的空白。這項工作不僅高效全面繪制出腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)的精氨酸反應(yīng)性圖譜，深化了對精氨酸功能多樣性的理解，更精準(zhǔn)鑒定出可靶向的功能性精氨酸位點，有力推動了針對此前被視為“不可成藥”蛋白質(zhì)的共價抑制劑研發(fā)，在基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化領(lǐng)域均具有重要科學(xué)意義和廣闊應(yīng)用前景。